免疫共沉淀(Co-lmmunoprecipitation)是利用抗原與抗體之間的專一性作用為基礎,從而用于研究蛋白質與蛋白質之間相互作用的一種方法。抗體與裂解液中相應的蛋白結合后,再與ProteinA/G偶聯的Sepharose或MagneticBeads孵育,通過離心或者借助磁力架獲得ProteinA/G磁珠-抗體-目的蛋白復合物,在高溫及還原劑的作用下,抗原與抗體解離,收集上清,上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白,再通過Western Blot或質譜(MS)鑒定蛋白質。其原理圖如下:

Q1：通過CoIP后WB驗證發現，沒有想要的目的條帶？

A：多方面原因造成:

1）有可能是樣品被蛋白酶降解，對應的策略是需要添加蛋白酶抑制劑，所有操作保持4℃以下冰上操作且避免反復凍融。

2）有可能是抗體濃度太低導致條帶較淺，則需要調整IP或WB抗體濃度，必要時設立濃度梯度，摸索最佳濃度。

3）抗體親和力太低，選用適合于IP或者WB的抗體。

4）有的IP抗體未與磁珠結合，這種情況需選用適合IP的磁珠。

5）若Tag未暴露在融合蛋白構象的表明，則需改變Tag融合表達部位。

6）裂解液鹽堿度太高，需用低鹽堿度的裂解液。

7）抗體選擇不當，更換抗體。

Q2：通過CoIP后WB驗證發現，雖然可見目的條帶，但是背景很高：

A：多方面原因造成:

1）由非特異帶白結合導致背景高，若要避色主特異性帶白結合，則需要在無血清溶液中裂解細胞，且在免疫沉淀前用protein(A/G)磁珠預洗免疫沉淀后增加漂洗次數和鹽堿度(高鹽或去垢劑)。

2）實驗儀器或試劑被污染，使用潔凈的儀器及實際。

3）轉移膜上的目特異吸附導致背景高，實驗操作過程中載手套，使用鑷子來取，不要接觸膜轉移面。

4）制備樣品中可能有不完全溶釋的大的蛋白復合體，則在制備樣品后進行知暫超聲處理(3次，每次5秒鐘 )，然后離心，取上清后進行后續試驗。

5）洗滌不徹底，則需要多次洗滌，并設新增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。

6）可能有非特異性蛋白吸附于珠子上，則須進行Preclearing以排非特異性吸付。

7）抗體本身待異性不好可能導數者景高，則須選擇合適的抗體，可以考慮單抗。

8）使用了過多的細胞或組織進行裂解導致背景高，則須減少樣本量，推薦100-500ug細胞裂解物。

9）蛋白降解也可能出現高背景的情況，盡量使用新鮮制備的樣品。

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