實驗原理
酵母核/膜體系文庫構建試劑盒，提供了一種從總RNA或者poly A+RNA獲得高質量全長cDNA文庫的方法。本試劑盒在GAL4酵母單雙雜系統以及基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統上，通過對PGADT7以及pPR3-N載體進行改造，額外增加了三框文庫的構建。本產品適用于從100~500μg不同來源的真核生物總RNA中，經過mRNA分離、單鏈cDNA合成、雙鏈cDNA合成、雙鏈cDNA分選、小量連接轉化、大量連接轉化，構建獲得高質量的酵母cDNA文庫。只需要一份樣品，合成一份雙鏈，即可同時構建獲得核體系、膜體系文庫。
產品優勢
金開瑞根據誘餌蛋白的定位自主研發了核蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒、核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒及膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒。相較于市面上其他的同款產品，本試劑盒針對建庫質量做了以下優化:
1、升級反轉錄酶:顯著增加了熱穩定性和半衰期，提高cDNA合成效率和片段完整性。
2、改造PGADT7和pPR3-N載體:創新的三框文庫構建方法，可保證片段長度、陽性率和文庫滴度等信息的一致性。
3、引入CCDB自殺基因:極大降低了空載的產生，基本實現100%陽性率。
4、DH10B:經過了高抗性壓力篩選，提高文庫轉化率。
5、超高性價比:提供全套必需試劑，無需額外購買，簡化實驗準備工作。
實驗流程
實驗時間表
結果展示
酵母核體系文庫構建：文庫插入片段PCR鑒定70%在750bp以上，文庫的陽性率>90%
＋：以PGADT7-T為模板
－：以水為模板
酵?膜體系?庫構建：文庫插入片段PCR鑒定80%在750bp以上，文庫的陽性率>90%
＋：以pPR3-N為模板
－：以水為模板
常見問題與解答
Q1:對于核體系酵母文庫和膜體系酵母文庫，該如何選擇試劑盒?
對于亞細胞定位顯示定位在細胞核的蛋白，選擇膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒;對于定位在細胞膜的蛋白，則選擇核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒;對于定位在細胞質的蛋白，可以選擇核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒。
Q2:核體系酵母文庫和膜體系酵母文庫在構建上有什么區別?
核體系酵母文庫是基于GAL4酵母單雙雜的系統，通過對PGADT7序列載體進行改造，而膜體系文庫是在基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統上，通過對pPR3-N序列載體進行改造。兩款試劑盒使用的載體不同，但實驗方法幾乎都是一致的。
Q3:雙鏈cDNA跑膠條帶小于預期大小
使用的總RNA或者mRNA存在降解、樣品不純、濃度太低等問題，可以通過以下方法解決:
(1)通過瓊脂糖凝膠檢測總RNA和mRNA的質量，確保質里和純度均沒有問題(如果RNA質量很好，但濃度太低，則使用更多的RNA來進行雙鏈的合成;如果RNA質量不行，則需要重新提取RNA);
(2)對RNA的穩定性進行檢測，如果RNA容易降解，檢查所用的離心管、tip頭等是否有RNase的污染，并換一種方法重新提取總RNA;
(3)為了更容易地確定是否是RNA的問題，請使用對照RNA進行平行反應。
Q4:如何檢測文庫質量，文庫容量低應該怎么解決?
對于我們提供的大腸桿菌文庫甘油菌，可以進行梯度稀釋后鋪板培養，第二天計算庫容量，同時挑取單克隆進行PCR擴增，以判斷插入片段長度和空載率。如果檢測出文庫容里低，有可能是連接效率低，可以通過以下兩種方式解決問題:
(1)檢查分級分離后雙鏈cDNA的濃度，雙鏈cDNA的濃度應該在100~200 ng/uL的濃度范圍內;
(2)按照試劑盒說明書中的連接體系，連接體系中線性化載體和雙鏈產物的配比不合適，或者連接體系中這兩者所加入的里太多均會影響連接效率。
Q5:雙鏈cDNA產物中存在較多<0.1Kb的條帶?
可能是PCR的循環數太多了，重新使用第一鏈產物進行第二鏈的合成PCR時減少3~4個循環數。
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