在現(xiàn)代生命科學(xué)研究的舞臺(tái)上，小干擾RNA（Small Interfering RNA, siRNA）猶如一把精準(zhǔn)調(diào)控基因表達(dá)的“手術(shù)刀”，以其高度特異性和高效性在基因沉默領(lǐng)域展現(xiàn)出了無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。siRNA，這一由雙鏈RNA分子組成的短片段，通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)特定mRNA序列精確互補(bǔ)配對(duì)，觸發(fā)RNA干擾（RNA Interference, RNAi）機(jī)制，有效抑制對(duì)應(yīng)基因的翻譯，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因功能的臨時(shí)、可逆性關(guān)閉。這一關(guān)鍵性技術(shù)不僅為研究人員打開(kāi)了深入探究基因功能、解析復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程的大門(mén)，更為疾病的分子機(jī)制研究、藥物靶點(diǎn)篩選以及基因療法開(kāi)發(fā)提供了強(qiáng)大的工具。

圖源：https://www.cnki.net

    siRNA的應(yīng)用領(lǐng)域廣泛而深遠(yuǎn)，無(wú)論是基礎(chǔ)研究中的基因功能驗(yàn)證、信號(hào)通路解析，還是轉(zhuǎn)化研究中的藥物靶標(biāo)驗(yàn)證、疾病模型構(gòu)建，乃至臨床研究中的個(gè)性化治療探索，siRNA都以其獨(dú)特的技術(shù)優(yōu)勢(shì)發(fā)揮著不可或缺的作用。其高度定制化特性使得研究人員能夠針對(duì)任何已知基因設(shè)計(jì)并合成特定siRNA，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的基因敲低，極大地推動(dòng)了生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究進(jìn)程。

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    然而，盡管siRNA技術(shù)的潛力與價(jià)值毋庸置疑，實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中仍會(huì)面臨諸如轉(zhuǎn)染效率、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性、基因干擾效果等一系列技術(shù)挑戰(zhàn)。這些問(wèn)題的妥善解決對(duì)于充分發(fā)揮siRNA技術(shù)的潛力，確保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性至關(guān)重要。武漢金開(kāi)瑞生物工程有限公司是一家專(zhuān)業(yè)致力于為全球制藥企業(yè)、診斷試劑企業(yè)、科研試劑研發(fā)企業(yè)、高校和科研院所以及大型醫(yī)院提供核酸及蛋白相關(guān)研究技術(shù)服務(wù)的高新技術(shù)企業(yè)。自2013年成立以來(lái)，我們已經(jīng)積累了超過(guò)10年的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，并擁有專(zhuān)業(yè)的技術(shù)團(tuán)隊(duì)。接下來(lái)，我們將針對(duì)siRNA研究中常見(jiàn)的問(wèn)題進(jìn)行深入探討，并提供科學(xué)、實(shí)用的解答與應(yīng)對(duì)策略。

    Q：siRNA轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題與建議有哪些？

    A：為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會(huì)考慮用3’AT/ABA進(jìn)行背景抑制，但是由于這兩種試劑對(duì)酵母生長(zhǎng)具有較大的毒性，后續(xù)可能會(huì)影響文庫(kù)篩選，因此在3’AT超過(guò)15mM，ABA超過(guò)1200ng/ml時(shí)我們會(huì)考慮將誘餌蛋白進(jìn)行截?cái)啵ㄟ^(guò)查閱文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)，截去轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，但是需要注意的是，截去的這一部分很有可能會(huì)影響到互作結(jié)果。

    Q：siRNA轉(zhuǎn)染常見(jiàn)問(wèn)題與建議有哪些？

    A：

    Q：我們需要提供什么信息用于 siRNA 的合成？金開(kāi)瑞可以幫助免費(fèi)設(shè)計(jì)嗎？

    A：您需要準(zhǔn)確地提供 siRNA 的 19 個(gè)核苷酸的靶序列和懸垂的合成物，或者您也可以提供相應(yīng)地基因的 Gene ID 或者 Accession Number，由金開(kāi)瑞公司技術(shù)人員為您免費(fèi)設(shè)計(jì)。
 

    Q：用 100nM 的 siRNA 轉(zhuǎn)染時(shí)只得到 50%沉默效率，我可以將 siRNA 的濃度增加到 200nM 甚至400nM 嗎？

    A：增加 siRNA 的濃度一般不能改進(jìn)沉默效率。高濃度的 siRNA 將可能導(dǎo)致去靶作用和對(duì)細(xì)胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率來(lái)自于合理的設(shè)計(jì)，在 100nM 甚至更低的濃度都可能有 75%的沉默效率。另外，低的轉(zhuǎn)染效率會(huì)導(dǎo)致低的沉默效率，建議您更進(jìn)一步優(yōu)化 siRNA 的導(dǎo)入條件。
 

    Q：沉默效果不理想，應(yīng)該如何處理？

    A：最常見(jiàn)的影響沉默效果的兩個(gè)原因是：轉(zhuǎn)染效率低和 siRNA 序列設(shè)計(jì)的效果不理想。如果您初次使用 siRNA 或采用了新的細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)沉默效果不佳，我們建議您對(duì)轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行檢測(cè)，并選擇優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。如果您已經(jīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化但是問(wèn)題依然存在，我們建議您換用另一種轉(zhuǎn)染試劑或是采用其他技術(shù)，這也許能提高轉(zhuǎn)染效率。如果已經(jīng)提高了轉(zhuǎn)染效率但是沉默效果仍然未達(dá)到要求，可能是因?yàn)閟iRNA序列設(shè)計(jì)的效果不理想。
 

    Q：一定需要陰性對(duì)照嗎？

    A：是，陰性對(duì)照是 RNA 干擾實(shí)驗(yàn)中不可缺少的。由于在超過(guò) 200nM 的濃度下，siRNA 有可能會(huì)導(dǎo)致非特異性的壓力反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)體系中必需設(shè)置陰性對(duì)照。它能夠幫助我們確認(rèn)基因表達(dá)水平的降低是否是序列特異性的 RNAi 的結(jié)果。由于 siRNA 的合成方法和工藝以及轉(zhuǎn)染試劑等因素可能導(dǎo)致廣泛的基因沉默現(xiàn)象。如果沒(méi)有陰性對(duì)照，研究人員很可能錯(cuò)誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當(dāng)作由 RNAi 引起的基因特異性沉默。
 

    Q：常用的陰性對(duì)照有哪些類(lèi)型？

    A：常用的陰性對(duì)照大體分為兩種，一種是使用通用陰性對(duì)照序列，該序列已經(jīng)被上千篇文章使用；另一類(lèi)是使用和靶基因 siRNA 打亂序列的 siRNA 作為陰性對(duì)照，這樣的陰性對(duì)照和通用序列相比較，一方面合成是按照定制產(chǎn)品價(jià)格合成的，另一方面，由于打亂序列是沒(méi)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的序列，有可能會(huì)產(chǎn)生 off target 現(xiàn)象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作為陰性對(duì)照。
 

    Q：在陰性對(duì)照體系中和實(shí)驗(yàn)體系中觀察到同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這是什么原因？

    A：這個(gè)結(jié)果充分說(shuō)明了設(shè)置陰性對(duì)照的必要性。該結(jié)果表明您所觀察到的表型不是序列特異性knockdown產(chǎn)生的表型，您需要降低 siRNA 的工作濃度。
 

    Q：用于對(duì)照的 siRNA 的最佳濃度是多少？

    A：陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的 siRNA 的濃度都應(yīng)該與基因特異性的 siRNA 的濃度相同。
 

    Q：在 siRNA 上進(jìn)行標(biāo)記的最佳位點(diǎn)在哪里？

    A：反義鏈的 5'端標(biāo)記會(huì)影響 siRNA 的沉默活性，所以不推薦標(biāo)記這個(gè)位點(diǎn)。在其他三個(gè)末端進(jìn)行標(biāo)記對(duì)沉默活性幾乎沒(méi)有影響。有研究表明正義鏈的 5'端標(biāo)記是最有效的化學(xué)合成位點(diǎn)。
 

    Q：金開(kāi)瑞siRNA套餐有什么優(yōu)勢(shì)？

    A：訂購(gòu)金開(kāi)瑞siRNA套餐，資深技術(shù)設(shè)計(jì)siRNA，在保證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率（≥80%）的前提下，siRNA可達(dá)到70%以上的沉默效果。若經(jīng)qRT-PCR鑒定，套餐中3對(duì)siRNA均未達(dá)到70%或以上的沉默效果，金開(kāi)瑞將根據(jù)您提供的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。如核實(shí)為siRNA設(shè)計(jì)問(wèn)題，則重新設(shè)計(jì)并免費(fèi)合成針對(duì)靶基因的另外3對(duì)siRNA。特殊物種（除人，小鼠，大鼠以外）及l(fā)ncRNA除外。
 

    Q：金開(kāi)瑞的siRNA套餐包含哪些內(nèi)容？

    A：金開(kāi)瑞的siRNA套餐里面含有針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)的3條siRNA，贈(zèng)送普通NC，NC-FAM，陽(yáng)性對(duì)照。

    1、NC-FAM：實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，請(qǐng)先用NC-FAM進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)您用的轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染NC-FAM，換液后可通過(guò)熒光直接觀察明確最佳轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排。一般情況FAM在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)內(nèi)就會(huì)淬滅。

    2、陽(yáng)性對(duì)照用途：提供的GAPDH siRNA均為驗(yàn)證過(guò)有效的siRNA。如果實(shí)驗(yàn)組和GAPDH組都未出現(xiàn)有效下調(diào)則有可能實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染步驟存在問(wèn)題，請(qǐng)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后再進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

    3、NC：用于確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中其它因素導(dǎo)致了目的基因的RNA水平變化。NC組實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)與空白組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
 

    Q：siRNA 導(dǎo)入到細(xì)胞內(nèi)選哪種方法？

    A：使用什么樣的轉(zhuǎn)染方法，很大程度上取決于您使用的細(xì)胞系：1.貼壁的、易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，我們推薦使用 Lipofectamin 2000 或 siRNA Mate 轉(zhuǎn)染試劑。2.懸浮的或原代的細(xì)胞，我們推薦使用電擊轉(zhuǎn)化方法；3.電擊轉(zhuǎn)化效率仍然很低的細(xì)胞，需要選擇載體系統(tǒng)。
 

    Q：剛開(kāi)始接觸 RNA 干擾技術(shù)，經(jīng)費(fèi)有限，如何確定研究體系？

    A：在開(kāi)始 RNA干擾研究之初，需要確定以下幾個(gè)方面：使用化學(xué)合成的 siRNA 還是使用載體構(gòu)建 shRNA？我們推薦使用化學(xué)合成的方法來(lái)篩選有效的目的片段，然后把篩選出來(lái)的目的片段插入到載體，進(jìn)行抗性篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，再做長(zhǎng)期研究。
 

    Q：反義核酸和 RNAi 有何差異？

    A：反義核酸和 RNAi 從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹：從原理上說(shuō)，反義核酸是一段與靶基因配對(duì)的單鏈 DNA 或類(lèi)似 DNA 的片段與靶基因結(jié)合，結(jié)果阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄或是翻譯，以往的研究表明在反義核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關(guān)性，這就在一定程度上限制了反義核酸的應(yīng)用。RNAi的作用機(jī)理是雙鏈的RNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致靶基因的切割和降解。siRNA 的序列可以選擇在高度特異針對(duì)靶基因的位置，也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術(shù)問(wèn)世以來(lái)，國(guó)外很多專(zhuān)業(yè)從事反義核酸研究的公司都紛紛轉(zhuǎn)向 RNAi研究。
 

    在致力于推動(dòng)siRNA技術(shù)廣泛應(yīng)用，助力科研人員攻克研究難題的過(guò)程中，我們深感責(zé)任重大。為了讓更多科研工作者能夠便捷、經(jīng)濟(jì)地獲取高質(zhì)量siRNA產(chǎn)品，享受到前沿基因沉默技術(shù)帶來(lái)的科研紅利，我們將特別推出一場(chǎng)史無(wú)前例的siRNA促銷(xiāo)活動(dòng)，全年最低，絕對(duì)的驚喜價(jià)！詳情請(qǐng)聯(lián)系您的對(duì)接銷(xiāo)售或官方客服，期待與您攜手合作，共同開(kāi)啟基因沉默研究的新篇章！

參考文獻(xiàn)：
J. Shen, W. Zhang, R. Qi, et al., Engineering functional inorganic-organic hybrid systems: advances in siRNA therapeutics [J]. Chemical Society Reviews, 2018, Vol.47 (6): 1969-1995.
https://www.cnki.net
RNAi 技術(shù)在抑制 H B V 復(fù)制和表達(dá)中的應(yīng)用