答疑|雙熒光素酶報(bào)告基因服務(wù)咨詢匯總

信息來(lái)源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2019-11-15 14:47:33

最近小編收到很多老師咨詢雙熒光素酶報(bào)告基因服務(wù)的留言，現(xiàn)選取了幾個(gè)共性問題給大家回復(fù)一下～

Q : 您好，我們實(shí)驗(yàn)室的學(xué)生做雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)轉(zhuǎn)染效率很低而且復(fù)孔重復(fù)不出來(lái)，想咨詢一下原因

A : 轉(zhuǎn)染效率低的話可以從三個(gè)方面改善，首先要確保細(xì)胞狀態(tài)是好的，通常我們選出處于分裂期的細(xì)胞，另外陽(yáng)性對(duì)照您可以選擇過表達(dá)的熒光蛋白質(zhì)粒，還有就是DNA的質(zhì)量尤為重要，最好是先酶切驗(yàn)證。

這個(gè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果很靈敏，有一定差異是正常的，通常只要確保它在一個(gè)數(shù)量級(jí)之內(nèi)即可。如果差異超出這個(gè)范圍可以從兩方面改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準(zhǔn)確。

Q : 樣品裂解效率低怎么解決呢？

A : 首先要確保實(shí)驗(yàn)者加入了足夠的裂解液，其次就是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間最好不要超過36小時(shí)，因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)加大裂解難度

Q : 海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，相對(duì)活性如何？

A : 在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲熒光素酶作用于甲蟲熒光素，而來(lái)源于海洋腔腸（Renilla reniformis)的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。雙報(bào)告基因技術(shù)（Dual-reporter assays）,結(jié)合了螢火蟲熒光素酶測(cè)試和海腎熒光素酶測(cè)試。

Q : 海腎熒光素酶載體有哪些？

A : 有4個(gè)不同的載體，pRL-SV40 載體、pRL-CMV 載體、pRL-TK 載體、pRL-null 載體。

Q : 雙熒光素酶報(bào)告基因服務(wù)應(yīng)用方向？

A :1. 驗(yàn)證microRNA同mRNA靶向互作。將待測(cè)mRNA的3’UTR序列插入報(bào)告基因載體，再共轉(zhuǎn)入該microRNA，如果螢光素酶活性下降，則提示為其靶序列。

2. 驗(yàn)證microRNA同lncRNA靶向互作。將候選的lncRNA序列插入報(bào)告基因載體中F-Luc的3’UTR區(qū)域，檢測(cè)螢光素活性。

3.啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析。將啟動(dòng)子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報(bào)告載體，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。

4. 啟動(dòng)子SNP分析。一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運(yùn)用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析其相對(duì)活性。

5. 驗(yàn)證特定轉(zhuǎn)錄因子同其調(diào)控序列的作用。將該序列（通常為啟動(dòng)子區(qū)域）插入報(bào)告基因載體，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)細(xì)胞中共轉(zhuǎn)過表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子，可分析轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)是否提高螢光素酶活性。

6. 可以分析信號(hào)通路是否激活。將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。例如，在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報(bào)告基因載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應(yīng)原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報(bào)告載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可以用于低氧相關(guān)通路的研究。

Q : 可以介紹一下貴公司的雙熒光素酶報(bào)告基因服務(wù)嗎?

A : 雙熒光素酶報(bào)告基因用于實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中作相關(guān)的或成比例的檢測(cè)，通常一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對(duì)照，使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測(cè)均一化。檢測(cè)基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來(lái)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體共轉(zhuǎn)染帶有不同的報(bào)告基因作為對(duì)照的第二個(gè)載體。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對(duì)改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。通過這種方法，可減少內(nèi)在的變化因素所削弱的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，如培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目和活力的差別，細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率。

Q : 請(qǐng)問貴公司的服務(wù)流程是怎樣的？

A : 我們的公司的服務(wù)流程依次是接受訂單及樣品、序列分析、合成或擴(kuò)增目的片段亞克隆至目標(biāo)載體、293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染pGL3-basic、pRL-TK質(zhì)粒、熒光素酶反應(yīng)發(fā)光檢測(cè) 、結(jié)果分析。

Q : 如果讓你們做，我需要提供什么呢？

A : 您需要提供：1.基因模板，需提供詳細(xì)的轉(zhuǎn)錄因子、目的基因或microRNA信息；2.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，如無(wú)特殊要求，金開瑞默認(rèn)為使用293T細(xì)胞，則無(wú)需提供。

Q : 最終實(shí)驗(yàn)做完了，你們給我的實(shí)現(xiàn)結(jié)果包括哪些？

A : 實(shí)驗(yàn)流程及完整報(bào)告一份，包括實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)、圖片、分析結(jié)果等。

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