百慕大草是一種重要的多年生暖季草坪草種，同時形成地下生長的根狀莖和地上生長的匍匐莖，是快速繁殖能力強的克隆植物。根狀莖和匍匐莖作為分別生長在地下和地上的兩種特殊莖，在許多多年生和克隆植物的越冬和生態(tài)入侵中起著重要作用。然而，由于根狀莖和匍匐莖很少在單一的植物物種中共存，這兩種莖之間的差異在分子水平上尚不清楚。

在本研究中，作者通過iTRAQ比較蛋白質(zhì)組分析，首次鑒定了百慕大草的根狀莖和匍匐莖中228種不同積累的蛋白質(zhì)種類(DAPs)。我們發(fā)現(xiàn)，228個DAPs相互作用，形成蛋白質(zhì)網(wǎng)絡，以調(diào)節(jié)不同的細胞活性和生化反應。我們還觀察到，生長在地下的匍匐莖表現(xiàn)出與地下生長的根狀莖類似的生理活性和DAP表達，這表明光可能在匍匐莖和根狀莖的分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果增加了我們對植物莖適應不同生長條件的了解。

匍匐莖和根狀莖均由百慕大草的基部芽組成。根狀莖呈白色和淡黃色，而匍匐莖呈淡綠色（圖1A）。雖然根狀莖和匍匐莖在節(jié)點和節(jié)點間都具有相似的植物組織結(jié)構，但這兩個莖有不同的節(jié)點間長度和直徑（圖1A-C）。顯微分析表明，根狀莖的橫切面細胞比匍匐莖的細胞多（圖1D，E），這與節(jié)間直徑測量結(jié)果一致（圖1C）。I2-KI染色進一步表明，根狀莖積累的淀粉比匍匐莖積累的淀粉更多（圖1F，G），與淀粉含量測定結(jié)果的一致（圖1H）。有趣的是，匍匐莖的可溶性蛋白質(zhì)含量明顯高于匍匐莖，而兩個莖的可溶性糖含量相似（圖1I，J）。根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，兩個莖顯示不同的顏色，匍匐莖的葉綠素和花青素含量顯著高于根狀莖（圖1K，L）。相反，根狀莖中的H₂O₂含量幾乎是匍匐莖的3倍（圖1M）。這些結(jié)果共同表明，百慕大草的莖和根莖在形態(tài)，解剖結(jié)構和生理活動方面有許多差異。

圖1 百慕大草品種陽江匍匐莖與根狀莖的解剖生理差異

2. 百慕大草匍匐莖與根狀莖節(jié)間蛋白質(zhì)組的比較

為了研究百慕大草中匍匐莖與根狀莖之間差異的分子機制，進行了iTRAQ蛋白質(zhì)組學分析，總共鑒定出4416種蛋白質(zhì)。在根狀莖和匍匐莖中，分別有68.2％和63.5％的蛋白質(zhì)變異系數(shù)（CV）值<20％（圖2A），定量比較表明，在匍匐莖與根狀莖中只有228種蛋白質(zhì)顯著差異積累。而其余4188種蛋白質(zhì)在兩種類型的莖中顯示相似的蛋白質(zhì)豐度（圖2B）。DAP的亞細胞定位預測進一步表明，匍匐莖中的DAP主要位于葉綠體，細胞質(zhì)和高爾基體中，而許多根狀莖中的DAP則被預測為細胞壁，質(zhì)外體和質(zhì)膜-定位的蛋白質(zhì)（圖2C）。

為了驗證iTRAQ定量結(jié)果，使用RT-qPCR確定了10個DAP編碼基因的表達水平。特別選擇了這十個DAP，以代表四種DAP。結(jié)果表明，五個基因在根狀莖中優(yōu)先表達，其他五個基因在匍匐莖中高表達（圖3A），這與iTRAQ定量結(jié)果一致（圖3B）。使用針對具有上述不同種類的倍數(shù)變化的四種DAP的Western blot分析，包括DAP8（植物色素A，PHYA），DAP91（過氧化氫酶，CAT），DAP152（熱休克蛋白70，HSP70）和DAP225（磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，PEPC），以進一步驗證iTRAQ定量結(jié)果。結(jié)果表明，根狀莖中PHYA和CAT的蛋白質(zhì)豐度更高，而HSP70和PEPC蛋白質(zhì)則優(yōu)先在匍匐莖中積累（圖3C）。

圖2 百慕大草品種陽江市匍匐莖和根狀莖的蛋白質(zhì)組比較

圖3選定差異蛋白種類的RT-qPCR和Western blot分析

3. 百慕大草匍匐莖與根狀莖的差異化生化途徑

分別進行GO和KEGG注釋以獲得DAP的功能信息。GO注釋表明228個DAP參與了21個生物學過程，包括代謝，對刺激的反應，定位的建立，信號傳導和生物節(jié)律。有趣的是，這21個GO類別都包含不同數(shù)量的DAP，這表明這些生物學過程可能在兩種類型的莖中受到不同的調(diào)節(jié)。根據(jù)獲得的DAPs的KEGG注釋信息，KOBAS分析進一步顯示，匍匐莖與根狀莖中有5和7條生化途徑顯著豐富（圖4A，B）。具體來說，匍匐莖DAP在光合作用、光合作用-天線蛋白質(zhì)、光合用生物中的碳固定和類黃酮生物合成中富集，而在根狀莖DAP在淀粉和蔗糖代謝、糖酵解和過氧化氫代謝中富集（圖4A，B ）。

搜索STRING數(shù)據(jù)庫以獲得DAP的可能的PPI信息。結(jié)果表明，分別有66.9％（85/127）和70.3％（71/101）的DAP可以在匍匐莖和根狀莖中形成復雜的PPI網(wǎng)絡（圖4C，D）。有趣的是，參與光合作用的20個DAP，參與類黃酮生物合成的6個DAP，參與糖酵解的7個DAP，以及參與淀粉和蔗糖代謝的6個DAP都聚集在PPI網(wǎng)絡中（圖4C，D）。這些結(jié)果與KOBAS分析結(jié)果相結(jié)合，共同暗示了匍匐莖中光合作用和類黃酮的生物合成受到嚴格調(diào)節(jié)，而根狀莖中糖酵解和淀粉代謝則受到嚴格調(diào)節(jié)。

圖4 不同積累蛋白質(zhì)種類的功能富集和蛋白蛋白相互作用分析

由于自然分化的百慕大草匍匐莖和根狀莖在生理活動和蛋白質(zhì)組分布上表現(xiàn)出巨大的差異，我們懷疑生長在地下的匍匐莖是否可能在某些方面表現(xiàn)得像根狀莖。為了驗證這種懷疑，我們把匍匐莖埋在土壤里，每隔五天對匍匐莖進行取樣。有趣的是，埋在土壤中的匍匐莖的顏色逐漸從淺綠色變成白色，同時淀粉的積累越來越明顯。。因此，匍匐莖的葉綠素和花青素含量隨著時間的推移逐漸下降，而淀粉和過氧化氫含量在處理后5天急劇增加，并保持快速增加率。

進一步分析了土埋匍匐莖中DAP的表達。RT-qPCR和Western blot均表明，隨著處理時間的延長，匍匐莖中四種DAP的表達水平逐漸接近根狀莖中的相同表達水平。

在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)127個和101個蛋白質(zhì)物種分別優(yōu)先積累在百慕大草匍匐莖和根狀莖中。這228個DAPs包括復雜的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡，以精細地調(diào)節(jié)兩種特殊莖中的不同細胞活動。具體來說，匍匐莖的光合作用和類黃酮生物合成受到顯著調(diào)控，根狀莖的蔗糖和淀粉代謝受到顯著調(diào)控。埋在土壤中的匍匐莖表現(xiàn)出與地下生長的根狀莖相似的生理活性和DAP表達，這表明光可能在DAP的差異積累和兩個莖的分化中起著重要的調(diào)控作用。這些結(jié)果不僅增加我們對植物莖適應不同生長條件的了解，而且還建議光控制管理可以用來調(diào)節(jié)百慕大草和其他擁有兩種特殊莖的匍匐莖和根狀莖的比率。