小鼠初級運動皮層（Mouse primary motor cortex，MOp）是額葉的一部分，主要負責計劃、控制、運動執行，尤其是任何延遲反應有關的動作。在垂直方向上，皮層可以分為L1-L6六層，每層的形態和功能都有區別。大腦皮層的谷氨酸能神經元按其投射特性分為腦內(IT)神經元、大腦下投射神經元(或錐體束神經元)和皮質丘腦投射(CT)神經元；γ-氨基丁酸(Gaba)能神經元可以根據發育起源于內側神經節隆起和尾神經節隆起進行分類，并可以通過小白蛋白(Pvalb)、生長抑素(Sst)、血管活性腸肽(Vip)和Lamp5等標記基因進一步分類。單細胞轉錄組學研究揭示了大腦細胞的高度多樣性，并報道了在單個皮層區域中存在數十到上百種細胞類型。然而，想要了解不同類型細胞對大腦功能的作用仍然缺乏一個高分辨率、包含細胞空間組織和連接信息的細胞圖譜。莊小威團隊使用MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，多路抗錯熒光原位雜交）來識別不同的細胞類型，并繪制它們在小鼠初級運動皮層(MOp)中的空間圖譜。通過整合MERFISH和神經逆行標記，進一步揭示了不同類型細胞的投射模式的復雜性。  

1.1 MERFISH成像及細胞聚類分析

作者選擇了258個標記基因進行MERFISH成像，其中包括已知的大腦皮層中主要神經元和非神經元細胞類型的典型標記基因，以及由單細胞和單核RNA測序聯合鑒定的神經元簇中差異基因表達以及互作分析選定的標記基因。MERFISH成像后將mRNA分配到單個細胞中，258個基因中有4個染色“不合格”，在隨后的分析中排除。從MERFISH中得到的單個細胞平均基因拷貝數在其他小鼠中可以重復，并且與混合RNA-seq測定的基因表達水平具有高度的相關性(圖1)。之后，通過無監督的聚類分析的MERFISH衍生的單細胞表達譜鑒定了39個興奮性神經元簇，42個抑制性神經元簇和14個非神經元簇(圖2)。

a,單個視場的解碼MERFISH圖像，白線為識別的細胞。比例尺，20 μm（左）和 5 μm（右）。b，DAPI（左）和poly（A）RNA（右）圖像。

圖2基于MERFISH的細胞類型分析，基于共同坐標框架的MERFISH圖像配準和細胞組成   

a，樹狀圖顯示了MERFISH鑒定的39個谷氨酸能簇、42個gaba能簇和14個非神經元簇之間的層次關系。b，用UMAP細胞類型進行分類。c&d，MERFISH 確定的細胞亞類與scRNA-seq 和snRNA-seq數據集確定的細胞亞類之間的對應關系。e，MERFISH對不同細胞簇染色示意。f，整個成像區域以及初級運動皮質(MOp)中三個主要細胞類別。 

1.2細胞分布的空間差異

MERFISH 圖像直觀地顯示了在 MOp 及其鄰近區域細胞的轉錄差異(圖3 a)。谷氨酸能細胞簇，特別是IT亞類，在全部分層都有分布(圖3b)。與幾乎跨越整個皮層的IT細胞不同，ET、NP、CT和L6b細胞只分布在較深的分層(圖3 b，c)。個別的谷氨酸能細胞簇沿著皮層方向呈現出區分明顯的、部分重疊的分布，而且這些細胞簇許多呈現分布寬度小于個別皮層的厚度。Gaba能神經元也表現出高水平的空間多樣性，Lamp5、Sncg和Vip亞類在表層更多，而Sst和Pvalb亞類在深層更多(圖3b，d) 。值得注意的是，在亞群水平，大多數Gaba能亞群優先分布在一個或兩個皮質層(圖3d)。作者還繪制了非神經元細胞的空間組織(圖3b，e)。在三個星形膠質細胞群中，星形膠質細胞1分布于各層，星形膠質細胞2分布于L1和白質中，星形膠質細胞3幾乎只分布于白質中。少突膠質細胞譜系分為少突膠質前體細胞和3個成熟少突膠質細胞群，成熟少突膠質細胞在白質中富集，少突膠質前體細胞均勻分布于各層。血管軟腦膜細胞形成皮層的最外層細胞。其他類型的非神經細胞在皮質層和白質中的分布更為分散。  

作者注意到不同細胞種群在空間上大量混合。為了量化每個細胞鄰近區域的細胞組成的復雜性，確定了每個細胞鄰近區域存在的不同細胞簇的數量，并觀察到高水平的局部細胞異質性，細胞鄰近區域的組成復雜性向深層遞增(圖3f)。

a，冠狀切片中細胞群的空間圖?；贏llen圖譜確定的MOp區域是灰色的。b，相同切片的谷氨酸能(左)、GABA能(中)和非神經元(右)細胞亞類的空間分布圖: 細胞呈圓形，指示細胞呈亞類染色，其他細胞呈灰色。比例尺，400μm。c-e，谷氨酸能神經元、非神經元細胞、整個成像區域的細胞簇在皮質深度的分布。f,L5和L6皮層(頂層)和不同亞類細胞鄰域復雜度的概率分布。細胞的鄰域復雜度定義為在給定細胞周圍半徑100μm范圍內存在的不同細胞簇的數目。

綜上所述，作者使用 MERFISH 生成了小鼠MOp及其鄰近區域的分子定義和空間解析的細胞圖譜。使用MERFISH對約30萬個細胞進行分析，識別出95個神經元和非神經元的細胞群，并揭示了大多數轉錄不同的細胞群的不同空間分布。作者的研究結果顯示了不同亞類神經元分布的層級限制，并揭示了先前未知的個別神經元簇的高分辨率空間映射。作者觀察到層狀組織不僅包括興奮性神經元，而且也有抑制性神經元，許多抑制性神經元簇優先位于一個或兩個皮層。此外，許多興奮性神經元簇沿皮層深度方向呈狹窄分布，顯示出個別皮層內較細小的層狀結構。

作者注意到，盡管神經元傾向于在亞類水平上形成表達譜不同的離散細胞群，但是單個亞類中的細胞簇往往表現出更多的漸變，這證明了腦細胞的離散和連續異質性共存。特別是占MOp興奮性神經元總數的70% 左右的IT神經元，在大腦皮層深處的分布形成一個連續的梯度。同時進行的scRNA-seq研究也觀察到同位皮層 IT 神經元之間基因表達的持續變化。通過空間解析的單細胞分析，作者觀察到 IT 神經元的基因表達隨皮層深度的相關變化。

a,對整個成像區域的 IT 神經元UMAP分析。b,冠狀切片上IT神經元的空間分布圖。IT 神經元像 a中被它們的集群特性所影響，而其他所有的細胞都是灰色的(左)。比例尺，200μm。皮質深度分布的個別 IT 集群也顯示(右)。c，在同一冠狀切片上，每個亞類(左側面板)以及 L2/3、 L4/5、L5和L6 IT亞類(4個右側面板)中單個簇的空間分布圖，比例尺，200μm。d，IT集群的 k- 近鄰圖中集群之間的連通度，每個集群用 a 中的彩色節點表示，節點之間的加權邊表示連通度。e,所有 IT 神經元跨皮層深度差異表達基因的標準化表達。在這里，差異表達基因是指表達基本不同的皮層深度(方法)。個別的 IT 神經元按照皮層深度上升的順序分類，基因按照表達最強的皮層深度分類。底部的顏色條顯示了細胞的集群特性。f,散點圖顯示了被細胞集群染色的L2/3，L4/5，L5和L6的單個IT神經元(左)和單個 IT 集群(右)的擬時序與正常皮質深度的關系。 

作者將霍亂毒素b亞單位(CTb)注射到三個皮層區域，即同側 MOs 區、SSp 區和顳關聯區(TEa) ，通過 CTb 成像識別MOp 中投射到這些靶區的神經元。通過結合MERFISH和神經逆向標記技術，作者進一步研究了個別的細胞類型與其投射靶點之間的關系。研究結果表明，MOp 神經元向其他皮層區域的投射形成了一個復雜的多對多網絡: 每個細胞簇投射到多個靶區(與之前對視覺皮層投射的觀察結果一致) ，每個靶區接收來自多個細胞簇的投射。作者還觀察到一些相似的神經元簇具有不同的投影特性，這些神經元簇具有逐漸變化的表達譜和重疊的空間分布。作者測量了三個目標區域，而更多的目標區域可以用這種方法來測量，以構建一個更全面的投影圖的細胞類型的MOp。作者設想 MERFISH 也可能與跨突觸病毒示蹤劑結合，生成一個高分辨率的細胞類型到細胞類型的連接圖。

a,逆行標記和MERFISH整合的工作流程。b,在不同皮層深度富集 MOs-projecting、SSp-projecting 和 TEa-ECT-PERI-projecting 細胞。富集定義為相關 CTb 陽性細胞的分數除以同一bin中所有 IT 和 L6b 細胞的分數。c,在簇中所有 CTb 陽性單投射細胞中，每個細胞簇中 MOs 投射、SSP 投射和 TEa-ECT-PERI 投射細胞的分數。d,餅圖顯示屬于每個細胞亞類（頂部）和簇（底部；僅前 10 個簇）的 MOs 投射（左）、SSp 投射（中）和 TEa-ECT-PERI投射（右）細胞的比例。e，分子和空間相似的 L6 IT 簇的投影特異性。顯示了 L6 IT 1-3 簇和 UMAP（插圖）的皮層深度分布，L6 IT1-3神經元如圖例顏色，其他 IT 神經元以灰色顯示（左）。餅圖顯示了屬于三個簇中的每一個的 MOs 投射和 TEa-ECT-PERI 投射 L6 IT 神經元的相對比例（右）。

有趣的是，某些分子水平和空間水平相似的 IT 團簇呈現出不同的投射模式。例如，幾乎所有CTb陽性的 L6 IT3神經元都投射到 TEa-ECT-PERI 上，但沒有投射到MOs和SSp上，而CTb陽性的 L6 IT1神經元大部分投射到MOs上，只有極少數投射到 TEa-ECT-PERI (圖5 c)。盡管三個 L6 IT 簇的基因表達譜相似，空間分布也基本重疊，然而MOs主要接受 L6 IT 1的輸入，而TEa-ECT-PERI則主要接受L6 IT 3的輸入(圖5 e)。

本文使用單細胞轉錄組成像技術——多路抗錯熒光原位雜交（MERFISH），生成一個小鼠初級運動皮質空間解析細胞圖譜。作者在小鼠初級運動皮層及其鄰近區域分析了大約30萬個細胞，鑒定了95個神經元和非神經元細胞簇，揭示了一個復雜的空間圖譜。研究發現不僅是興奮性神經元細胞簇，而且大多數抑制性神經元細胞簇都采用層狀分布。腦內（IT）神經元沿皮層深度軸形成了連續的梯度變化，其單個細胞的基因表達與其皮層深度相關。此外，作者將MERFISH與逆行標記相結合，探測小鼠初級運動皮質(MOp)神經元的投射目標，發現它們的皮層投射形成了一個復雜的網絡，單個靶區接收來自多個神經元簇的輸入，單個神經元也會投射到多個靶區。

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Zhang M,Eichhorn SW, Zingg B, et al. Spatially resolved cell atlas of the mouse primarymotor cortex by MERFISH. Nature. 2021;598(7879):137-143.

doi:10.1038/s41586-021-03705-x