雙分子熒光互補(BimolecularFluorescent Complimentary, BiFC)技術(shù)是指通過具有相互作用親和力的兩個蛋白質(zhì)，將分別與其相連的熒光蛋白片段拉近，組裝成完整的熒光蛋白，從而表征蛋白質(zhì)相互作用的發(fā)生及其空間位置。

    當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A與蛋白質(zhì)B在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時，它們各自的熒光蛋白片段也會隨之靠近，形成完整的熒光蛋白構(gòu)象。這種構(gòu)象恢復(fù)使得熒光蛋白能夠發(fā)出特征熒光，從而在顯微鏡下可視化地反映出蛋白質(zhì)A與B的相互作用。

雙分子熒光互補驗證蛋白互作的原理圖

BIFC實驗流程

    ● 構(gòu)建融合蛋白：設(shè)計并合成針對目標(biāo)蛋白A和B的特異性引物，將其分別與熒光蛋白N端和C端片段基因融合，構(gòu)建相應(yīng)的表達(dá)載體。

    ● 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將含有融合蛋白A-N端和B-C端片段的載體同時或分別轉(zhuǎn)入感興趣的細(xì)胞系，實現(xiàn)融合蛋白的共表達(dá)。

    ● 熒光觀察：轉(zhuǎn)染后一段時間（通常24-48小時），使用熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞，若觀察到綠色（或?qū)?yīng)熒光蛋白顏色）熒光信號，說明蛋白質(zhì)A和B發(fā)生了相互作用。

BIFC技術(shù)優(yōu)勢

    ● 活細(xì)胞內(nèi)檢測：能夠在細(xì)胞生理狀態(tài)下直接觀察蛋白質(zhì)相互作用，保留了時空動態(tài)信息。

    ● 高特異性：只有當(dāng)目標(biāo)蛋白相互作用時，熒光信號才會出現(xiàn)，減少了假陽性結(jié)果，提高了檢測的特異性。

    ● 多色標(biāo)記：通過使用不同顏色的熒光蛋白對，可同時檢測多個蛋白質(zhì)相互作用，實現(xiàn)多維度、多層次的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)研究。

    ● 直觀且定量：通過熒光強度衡量互作程度，可以通過熒光強度定量分析軟件進(jìn)行半定量或定量評估，為研究蛋白質(zhì)互作的動態(tài)變化和強度提供直觀且量化的數(shù)據(jù)。

    ● 適用于多種生物體系：廣泛適用于動物、植物、微生物等生物體系，在植物研究中，尤其適用于研究蛋白質(zhì)在特定細(xì)胞器、細(xì)胞結(jié)構(gòu)或特定生理條件下的互作。

    ● 檢測弱或瞬時相互作用：對低親和力、短暫相互作用敏感，能夠揭示一些傳統(tǒng)方法難以檢測到的相互作用。

BIFC技術(shù)應(yīng)用

    ● 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)研究：揭示復(fù)雜信號通路中蛋白質(zhì)間的直接相互作用。

    ● 細(xì)胞內(nèi)定位與動態(tài)研究：觀察蛋白質(zhì)相互作用在細(xì)胞內(nèi)的空間分布及其隨時間的變化。

    ● 藥物篩選與驗證：檢測候選藥物對特定蛋白質(zhì)相互作用的影響，評估其生物活性。

    ● 植物科學(xué)：研究植物生長發(fā)育、逆境響應(yīng)、信號傳遞等過程中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)互作。

    ● 神經(jīng)科學(xué)：揭示神經(jīng)元間或神經(jīng)元內(nèi)部蛋白質(zhì)的相互作用，如突觸形成、神經(jīng)遞質(zhì)釋放、離子通道調(diào)控等。

    ● 癌癥研究：研究致癌基因與抑癌基因、癌蛋白與微環(huán)境因素的相互作用，揭示癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機制，為診斷、預(yù)后評估和個性化治療提供依據(jù)。

BIFC實驗優(yōu)化與注意事項

    ● 融合片段選擇：選擇對熒光蛋白功能影響較小的片段融合位點，確保片段重組后熒光蛋白功能恢復(fù)。

    ● 熒光蛋白選擇：考慮熒光蛋白的亮度、穩(wěn)定性、光譜特性等因素，選擇最適合實驗條件的熒光蛋白。

    ● 對照設(shè)置：包括陰性對照（表達(dá)單個熒光蛋白片段的細(xì)胞）和陽性對照（已知存在相互作用的蛋白質(zhì)對）。

    ● 轉(zhuǎn)染效率與表達(dá)水平監(jiān)控：確保細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率足夠高，且融合蛋白表達(dá)水平適中，避免過表達(dá)干擾。

BIFC實驗設(shè)計與結(jié)果解讀

載體構(gòu)建

    如上圖所示，BiFC系統(tǒng)包含兩個質(zhì)粒，一個質(zhì)粒上帶有到Y(jié)FP蛋白的N端173個氨基酸，另一個質(zhì)粒上帶有YFP蛋白C端155個氨基酸。將待測蛋白A和B分別構(gòu)建到兩個載體上，與YFP的N部分和C部分分別融合表達(dá)，如果A和B蛋白能夠結(jié)合，則YFP的兩個部分也能重新組合在一起發(fā)出熒光。載體上分別帶有Myc標(biāo)簽和HA標(biāo)簽，供WB驗證。

結(jié)果解讀

轉(zhuǎn)染煙草后拍照檢測

    ● 默認(rèn)分組方式如上圖所示，每組每個視野都會拍攝熒光、明場以及融合3張照片；

    ● “YN173-P1 + YC155-P2”為陽性對照，“P1”和“P2”是已知能夠互作的蛋白；

    ● “YN173 + YC155”為陰性對照，轉(zhuǎn)染的一對空載質(zhì)粒，不會檢測到熒光；

    ● “YN173-A + YC155-B”為實驗組，“A”和“B”指代待驗證是否互作的一對蛋白，在陰陽性對照正常的情況下，如果實驗組能檢測到熒光，說明兩個蛋白能夠互作，反之說明兩個蛋白不能互作；

    ● “YN173-A + YC155”和“YN173 + YC155-B”為單分子對照組，同陰性對照不會檢測到熒光。

    ● 由于融合表達(dá)蛋白空間構(gòu)象的問題，有時在沒有檢測到互作的情況下，調(diào)換兩個蛋白的BiFC載體重新驗證，又能夠檢測到互作。