一、PCR產(chǎn)物的T載體克隆

（一）重組T質(zhì)粒的構(gòu)建

一．原理

       外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。

DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能，而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒(méi)有的特性，即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來(lái)。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低，一般可通過(guò)提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來(lái)提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應(yīng)分為3 步：首先，T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP復(fù)合物；然后，酶-ATP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵，把切口封起來(lái)。連接反應(yīng)通常將兩個(gè)不同大小的片斷相連。因?yàn)镈NA片斷有兩個(gè)端點(diǎn)，所以切割時(shí)出現(xiàn)兩種可能，一種是單酶切，另一種是雙酶切，這兩種酶切方法在基因工程操作中都經(jīng)常用到。對(duì)于單酶切來(lái)說(shuō)，載體與供體的末端都相同，連接可以在任何末端之間進(jìn)行，這樣就導(dǎo)致了大量的自連接產(chǎn)物。為了減少自環(huán)的高本底，可對(duì)載體進(jìn)行5’除磷酸處理，原理是連接酶只能連接DNA片斷的3’OH末端與5’端，所以除磷后載體不會(huì)自環(huán)。一旦有外源片斷插入時(shí)，由外源片斷提供5’端就能與載體進(jìn)行連接。通過(guò)這種方法可大大減少由載體的自環(huán)造成的高本底。對(duì)于雙酶切來(lái)說(shuō)，無(wú)論載體與供體同一片段上都有不同的末端，這樣就避免了載體與供體的自環(huán)，能使有效連接產(chǎn)物大大增加。雙酶切的另一個(gè)特點(diǎn)是能將供體分子定向連接到載體上。

        連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下粘末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此采取折中的溫度，即12-16℃，連接12-16h（過(guò)夜），這樣既可最大限度地發(fā)揮連接酶的活性，又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。Taq DNA酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，其DNA雙鏈前后末端都有一個(gè)游離的A堿基，可以與pGEM-T Easy Vector 末端游離的T堿基互補(bǔ)形成環(huán)狀重組T質(zhì)粒。

 

二．材料與方法

1 材料

外源DNA片斷

2 儀器、用具

移液槍、碎冰

3 試劑

pMD 18-T Vector；Ligation buffer；T4 ligatease；rATP

4 方法

連接體系如下：

16℃連接過(guò)夜。

 

（二）重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的鑒定

1 材料

E.coli JM109菌株

2 儀器、用具

超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器

3 試劑

(1) CaCl2、LB平板（見(jiàn)附錄）；SOC培養(yǎng)基（見(jiàn)附錄）；SOB培養(yǎng)基

(2) RNase A1；Buffer S1；Buffer S2；Buffer S3；Buffer W1；無(wú)水乙醇的Buffer W2a

(3) 1×電泳緩沖液（TAE）；溴化乙錠溶液（EB）[有毒，小心]；瓊脂糖；6×加樣緩沖液

(4) 酚；氯仿；異戊醇

(5) ddH2O；10×PCR Buffer (Mg2+ plus)；dNTP；M13+；M13-；TaKaRa rTaq酶

 

4 方法

1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備

(1) 取大腸桿菌JM109保存液50μl，接種于4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中，37℃，300rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，第二天取50μl 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB（或SOB）液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h至OD600=0.35～0.4，在無(wú)菌操作臺(tái)上取1ml菌液于1.5ml離心管中，冰浴10min。

(2) 4℃，5000rpm離心2min，去上清液。

(3) 加入750μl預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰浴30min。

(4) 4℃，5000rpm離心2min，棄上清液。

(5) 加入100μl 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體，冰浴2h后，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>