以自建細(xì)胞系(laryngeal squamous carcinoma-1, LSC-1)第12代的某一被細(xì)菌污染的細(xì)胞株采取救治,比較效果并分析細(xì)胞生物學(xué)特性。

實(shí)驗(yàn)方法

1)抗生素法:

       細(xì)菌培養(yǎng):用無抗生素完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞3 d,收集上清離心后將沉淀物接種于血瓊脂培養(yǎng)基, 35e培養(yǎng)。

       所采用的抗生素包括臨床常用的15種抗生素，抗生素最適抑菌濃度篩選:根據(jù)細(xì)菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果選出敏感抗生素,每種抗生素從最低抑菌濃度MIC到最高耐藥濃度分別配制6個(gè)濃度梯度。將LSC-1細(xì)胞按1*104/孔種96孔板,細(xì)胞貼壁后加入含敏感抗生素的完全培養(yǎng)液,24 h后換無抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng)1 d,如此重復(fù)3次,連續(xù)7 d。

 

2)抗生素聯(lián)合巨噬細(xì)胞吞噬法:

        將上述抗生素處理過的細(xì)胞再用小鼠的巨噬細(xì)胞處理。巨噬細(xì)胞的制備:將滅菌的玻璃粉與0. 9%氯化鈉注射液混和注入小鼠腹腔, 3 d后脫頸處死動物,無菌操作取小鼠腹腔液,離心收集巨噬細(xì)胞,與LSC-1細(xì)胞混合培養(yǎng), 3 d后換液,棄去巨噬細(xì)胞。間隔一周后再用巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)一次。

 

3)裸鼠體內(nèi)接種法:

        將LSC-1細(xì)胞按1*106個(gè)/mL接種裸鼠腋下皮下,連續(xù)觀察,當(dāng)腫物長至約1cm3后,脫頸處死動物,無菌操作取出腫物,采取組織塊法做組織細(xì)胞培養(yǎng)。

 

效果鑒定

免疫組織化學(xué)鑒定:

將上述3種方法處理的LSC-1細(xì)胞種植在直徑為15 mm的無菌圓形蓋玻片上,貼壁后做角蛋白AE1 /AE3免疫組化染色、HE染色

 

細(xì)胞周期鑒定:

    采用流式細(xì)胞儀測量碘化丙啶標(biāo)記細(xì)胞的熒光強(qiáng)度,分析DNA含量。測試3種方法處理的LSC-1細(xì)胞周期,并與該細(xì)胞建系初期的第3代細(xì)胞狀況做比對。

 

抗生素撤離觀察:

    用無抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)3種方法處理的細(xì)胞,連續(xù)觀察3周,取細(xì)胞上清做細(xì)菌培養(yǎng)。

 

細(xì)胞系的維持、凍存與復(fù)蘇:

將無抗生素培養(yǎng)3周的細(xì)胞按常規(guī)方法凍存,并于1個(gè)月后復(fù)蘇,觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

 

結(jié)果

        自建人喉癌細(xì)胞系LSC-1傳至第12代以后,細(xì)胞生長速度變慢,已貼壁細(xì)胞變圓、漂起、死亡,細(xì)胞間隙出現(xiàn)可運(yùn)動的微小生物,但培養(yǎng)液依然清亮不渾濁,收取上清液離心,將沉淀物行常規(guī)血瓊脂培養(yǎng), 24 h結(jié)果為無菌生長,培養(yǎng)5~7 d后開始出現(xiàn)灰白色細(xì)小菌落,光滑濕潤,有透明溶血環(huán),全自動細(xì)菌鑒定儀生化鑒定條檢測為嗜麥芽寡養(yǎng)食單胞菌,該菌為非發(fā)酵革蘭陰性桿菌。細(xì)菌藥敏結(jié)果:在15種抗生素中,該菌僅對頭孢他啶、哌啦西林、頭孢哌酮/舒巴坦3種藥物敏感，其余均耐藥。

 

3.1 抗生素法除菌效果

        經(jīng)篩選, LSC-1細(xì)胞可耐受的抗生素最佳抑菌濃度分別為:哌啦西林64 mg /L、頭孢他啶2 mg /L、頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L。LSC-1細(xì)胞在哌啦西林和頭孢他啶最佳抑菌濃度中分別傳代一次,在頭孢哌酮/舒巴坦中傳代3次,并每種細(xì)胞各凍存3株。復(fù)蘇情況:哌啦西林3株均未貼壁,頭孢他啶兩株復(fù)蘇后貼壁,但生長一周后均出現(xiàn)細(xì)菌,細(xì)胞死亡;另一株第二次凍存,再次復(fù)蘇后生長良好,但抗生素撤離后出現(xiàn)細(xì)菌,經(jīng)鑒定仍為嗜麥芽寡養(yǎng)食單胞菌。頭孢哌酮/舒巴坦3株復(fù)蘇后均能存活,但生長緩慢,一周傳代一次,仍有少量細(xì)菌,抗生素撤離后重又出現(xiàn)細(xì)菌污染。在3種抗生素中,頭孢哌酮/舒巴坦抗菌作用和細(xì)胞生長狀態(tài)最好,頭孢他啶對細(xì)胞損傷較大,細(xì)胞表面粗糙,狀態(tài)較差。

 

3.2 抗生素聯(lián)合巨噬細(xì)胞吞噬法除菌效果

        比較頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞先后使用和二者交替使用的除菌效果,并觀察細(xì)胞凍存復(fù)蘇后的傳代次數(shù),具體方法為:頭孢哌酮/舒巴坦32 mg /L培養(yǎng)1次、2次、4次后,再分別與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)2次,各凍存1株;頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞交替培養(yǎng)3次,凍存1株。復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài):頭孢哌酮/舒巴坦和巨噬細(xì)胞依次使用者中,抗生素使用次數(shù)較多的細(xì)胞傳代次數(shù)較多(5代);二者交替使用的細(xì)胞狀態(tài)更好于前3株細(xì)胞,且傳代次數(shù)也最多(6代)。然而所有細(xì)胞最終因狀態(tài)不佳或污染重現(xiàn)而死亡。

 

3.3 裸鼠體內(nèi)接種法除菌效果

        腫瘤細(xì)胞接種裸鼠體內(nèi)40 d后開始出現(xiàn)腫塊, 60d長至1 cm3左右。處死動物取出腫物,瘤體質(zhì)量0. 39 g,體積為0. 8 cm*0. 6 cm*0. 4 cm。將組織塊培養(yǎng)于含三抗的完全培養(yǎng)基, 14 d后改用無抗生素培養(yǎng),持續(xù)培養(yǎng)3周,細(xì)胞生長良好。之后自然傳代8次,凍存1個(gè)月后復(fù)蘇,細(xì)胞仍能貼壁生長。取上清液做細(xì)菌培養(yǎng),結(jié)果為無菌生長。

 

3.4 細(xì)胞形態(tài)及生物學(xué)特性

       抗生素處理及裸鼠接種后的LSC-1細(xì)胞形態(tài)與LSC-1第三代基本相同,細(xì)胞呈多邊形,有鋪路石感。

 

       免疫組織化學(xué)細(xì)胞角蛋白染色,裸鼠接種后的和抗生素處理的細(xì)胞均有AE1 /AE3陽性表達(dá),但前者陽性比例(圖1H)與第三代細(xì)胞(圖1G)接近,后者陽性表達(dá)較少。

 

        HE染色,接種裸鼠的LSC-1細(xì)胞具有高度的異型性:細(xì)胞形態(tài)及大小不等;核呈多形性:大小、形態(tài)及染色各異,胞核與胞質(zhì)比例增大(接近1B1),核仁粗大,數(shù)目增多,核分裂象增多,出現(xiàn)不對稱、多極性等病理性核分裂,偶見巨核細(xì)胞,胞質(zhì)有糖原顆粒,與LSC-1第三代細(xì)胞形態(tài)相一致。

 

3.5 細(xì)胞倍體狀況及細(xì)胞增殖周期分析結(jié)果

        用頭孢哌酮/舒巴坦處理3次后, LSC-1細(xì)胞周期直方圖雖為近二倍體圖像,但S期、G2M期細(xì)胞峰較高,仍具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)。裸鼠接種的LSC-1細(xì)胞呈現(xiàn)非整倍體圖像,且二倍體和異倍體的S期、G2M期峰均較高,更接近第3代LSC-1細(xì)胞周期DNA含量分布。3種細(xì)胞各核型比例:裸鼠接種細(xì)胞仍保持二倍體和異倍體核型,分別占44. 92%和55. 08%,與第3代細(xì)胞(二倍體41. 52%、異倍體58. 48% )基本相同,而頭孢哌酮/舒巴坦處理的細(xì)胞全部為二倍體,異倍體細(xì)胞消失。

 

討論

        挽救污染細(xì)胞的方法有抗生素除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法和動物接種除菌法,其中較常使用的是抗生素沖擊法。清除效果的檢驗(yàn)應(yīng)包括無菌檢驗(yàn)和細(xì)胞性狀評估。無菌檢驗(yàn)指細(xì)胞在無抗生素培養(yǎng)基中傳代3~4次,顯微鏡下觀察無細(xì)菌、培養(yǎng)上清細(xì)菌無菌生長,方可確定污染細(xì)菌被消除干凈。細(xì)胞的組織來源鑒定和染色體分析是細(xì)胞系鑒定的兩個(gè)主要方面。LSC-1為喉鱗狀上皮來源細(xì)胞系,參照相關(guān)文獻(xiàn),我們選用角蛋白免疫組織化學(xué)鑒定和細(xì)胞周期DNA倍體分析方法評估細(xì)胞性狀。

 

        細(xì)胞系中麥芽窄食單胞菌有可能來源于標(biāo)本本身。由于該菌對氨基糖甙類和很多B-內(nèi)酰胺類(包括碳青霉烯類)天然耐藥,故常規(guī)培養(yǎng)液中的青、鏈霉素不能完全抑制其生長。有研究顯示,該菌僅對少數(shù)幾種抗生素如頭孢哌酮/舒巴坦、頭孢他啶等耐藥性較低,本文得到了相同的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)采用15種抗生素對該菌的抑菌效果進(jìn)行測定,找出其中有效的3種,又分別對這3種抗生素的6個(gè)梯度濃度測試,最后確定抗菌效果最好、細(xì)胞毒性最小濃度為32 mg /L頭孢哌酮/舒巴坦,其作用能控制細(xì)菌生長并使細(xì)胞傳代2~3代,當(dāng)聯(lián)合使用小鼠巨噬細(xì)胞后又使細(xì)胞傳代次數(shù)增加到5~6代。然而,抗生素的作用主要是通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成達(dá)到抑制細(xì)菌生長的效果,并不能直接殺死細(xì)菌。有研究表明,單獨(dú)使用抗生素處理細(xì)菌污染的KB口腔上皮樣癌細(xì)胞系,不能完全清除細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌。巨噬細(xì)胞在體外沒有其他免疫細(xì)胞和抗體等因素的參與下,其吞噬功能是有限的,在這里僅起到輔助抗生素的作用, (相關(guān)的報(bào)道有用于挽救支原體污染的細(xì)胞,但體外抗細(xì)菌的作用尚未見報(bào)道),故當(dāng)抗生素撤離后以上2種方法處理的細(xì)胞中細(xì)菌再次出現(xiàn)。

 

        另外,抗生素對培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和性狀都有一定的影響。本實(shí)驗(yàn)有效的3種抗生素中,頭孢他啶毒性最大,頭孢哌酮/舒巴坦雖然毒性相對弱一些,但也使喉癌細(xì)胞角蛋白AE1 /AE3表達(dá)有所減少、DNA倍體分析原有的異倍體細(xì)胞消失,接種裸鼠后不能成瘤。因此可以認(rèn)為,有針對性地使用抗生素或許可以短期控制住細(xì)胞系中污染細(xì)菌生長,但同時(shí)可能伴隨有細(xì)胞生物學(xué)特性變化。進(jìn)而推論,抗生素沖擊法也難控制細(xì)菌再次暴發(fā)性生長,而且對細(xì)胞更有損傷。至于那些不做污染菌的分離和鑒定、僅靠單一某種廣譜抗生素來對付所有污染細(xì)菌,或是僅參照臨床用藥劑量來設(shè)計(jì)抗生素濃度等做法更不可取。

 

        動物體內(nèi)接種除菌法是利用動物的免疫系統(tǒng)來消滅污染微生物的方法。常用的動物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠,其T細(xì)胞缺如致使特異性細(xì)胞免疫功能喪失,但B細(xì)胞功能依然正常以及非特異性細(xì)胞免疫系統(tǒng)NK細(xì)胞活力強(qiáng),故可用于腫瘤細(xì)胞的污染清除。細(xì)菌在裸鼠體內(nèi)可被巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬、NK細(xì)胞殺滅、IgM、IgG類抗體結(jié)合病菌后激活補(bǔ)體殺死或溶解等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,接種BALB /c-nu裸鼠之后的LSC-1細(xì)胞形態(tài)良好、生長旺盛,細(xì)胞間沒有細(xì)小微生物,傳代多達(dá)8次后,細(xì)胞凍存和復(fù)蘇仍能正常生長,并在抗生素撤離后細(xì)胞生長狀態(tài)不變,細(xì)菌培養(yǎng)為陰性。

 

        細(xì)胞生物學(xué)特性上,細(xì)胞角蛋白陽性表達(dá)比例較高,與第3代LSC-1接近,保持了原有上皮來源的性質(zhì),組織病理學(xué)觀察仍具有高度的異型性及腫瘤細(xì)胞的特征,細(xì)胞倍體及增殖周期分析結(jié)果顯示異倍體細(xì)胞及S期細(xì)胞的比例與第3代細(xì)胞相同。實(shí)驗(yàn)表明,利用裸鼠去除腫瘤細(xì)胞系中的污染細(xì)菌是最為理想的方法,既能徹底清除污染細(xì)菌,又能保持腫瘤細(xì)胞的來源特征和惡性特性。