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多克隆抗體制備流程

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2018-04-10 15:39:16

抗血清，通常指人工被動免疫后所制成的多克隆抗體，它是免疫化學的主要內容。抗血清也成為免疫血清，主要有免疫原的制備、動物免疫、放血、抗血清的分離、抗血清的分析和鑒定。

一、免疫原的制備

免疫原，是人工將抗原制成能刺激機體引起體液或細胞免疫的反應物質。免疫原由質量好的抗原和佐劑制成。常用佐劑弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑。

完全佐劑的具體制法：取羊毛脂：石蠟油1:3比例混合高壓滅菌，每毫升加入1.5mg卡介苗制成，使用時同抗原1:1等體積混合，乳化為油包水狀態。

不完全佐劑為完全佐劑去除卡介苗制成。

二、動物免疫

常用于動物免疫的動物有家兔（新西蘭大耳白、日本大耳白等）、羊（波爾山羊），豚鼠等，其中家兔對抗原的免疫反應性好、個體大小合適等優點使用最多，兔的IGG不分亞類，實驗中易于管理。用于免疫的動物要求適齡、健壯、無感染性疾病，雄性最好。

免疫部位：多采用腳掌，腹股溝淋巴結、大腿肌肉，皮下等，采用多部位配合免疫效果好。

免疫劑量根據免疫動物、抗原分子大小，免疫方案不同有較大的區別。根據抗原量不同，可分為微量，常量及大量免疫法。微量免疫抗原在微克級別；常量免疫抗原量在1-10mg左右；大量免疫抗原免疫劑量在50-100mg；小鼠在微克級別，兔子在1毫克到幾毫克間。

三、微量采血、效價檢測

免疫動物最好先用5-10mg的卡介苗刺激動物，激發免疫系統，通常稱為基礎免疫，7-10天可起到作用。接著注射第一針，產生初次抗體，IgM型抗體較多；2-4周注射第二針，免疫3-5次后微量采血檢測效價，微量采血再免疫后7-10天采集。兔子采用耳緣靜脈或動脈，羊可耳緣靜脈也可頸靜脈采血。

兔子采血：冬季血液流動緩慢，用雙手揉搓兔子耳朵，待耳中間動脈血管鼓起，用針頭輕輕刺破動脈（注意，不要擦拭酒精或其他液體），這時血液呈滴狀流出，用EP管接住即可。夏季由于血液流動活躍，可采用靜脈取血。

羊：用剪刀或者電動推子將耳朵上的毛剃光，揉搓耳朵，待血管鼓起，用注射器抽取。

檢測效價的方法：簡潔ELISA、免疫擴散、單向擴散。或者根據制備抗體的目的選擇其他檢測、分析方法。

四、免疫血清的采集

微量采血檢測達到預期目的后，一次性放血處死。

兔子、豚鼠采用心臟采血、羊采用靜脈放血處死。

豚鼠采血5-10ml'，兔子100ml左右，羊，2500ml左右。小鼠用摘取眼球放血。

血液，采血時注意無菌操作，采集后放入面積較大的無菌容器中，先室溫凝固30min，再放入37度溫箱凝固，最后放入4度冰箱充分凝固。完全凝固后，采用3000-5000rpm離心20min得到透明血清。

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