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應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析SEMA3B-AS1抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化機(jī)制

信息來(lái)源：金開(kāi)瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2018-07-16 17:18:47

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題目：SEMA3B-AS1-inhibited osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells revealed by quantitative proteomics analysis.

期刊：journal of cellular physiology

影響因子：3.923

合作技術(shù)：iTRAQ、病毒包裝、細(xì)胞功能檢測(cè)

研究背景及思路：

常見(jiàn)的非編碼RNA包括lncRNA、circRNA、miRNA，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡中具有重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，非編碼RNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。作為非編碼RNA的一員，lncRNA已被證實(shí)廣泛在各類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

新骨形成被認(rèn)為是治療骨相關(guān)疾病的一種新型的可替代方法，例如骨質(zhì)疏松、骨架變形、骨折等。許多研究旨在提高新骨形成過(guò)程以希望治愈這些疾病。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSC）是具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞展現(xiàn)多種分化潛能的成纖維樣多能干細(xì)胞，在新骨形成過(guò)程和骨質(zhì)疏松發(fā)病等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）被發(fā)現(xiàn)參與成骨分化及骨質(zhì)疏松的過(guò)程，比如H19通過(guò)吸附miRNA-675促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，MEG3通過(guò)靶向BMP4或者miR-140-5p來(lái)提高M(jìn)SC的骨生成。但是lncRNA參與hMSC分化過(guò)程以及具體的機(jī)制目前不是很清楚。

hMSC的分化是接受不同環(huán)境刺激后發(fā)生的過(guò)程，細(xì)胞表面受體在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，可以起到信號(hào)級(jí)聯(lián)及放大的作用。SEMA家族蛋白被發(fā)現(xiàn)在骨生成或者骨疾病中發(fā)揮作用。如Sema6d、mema4d、sema3a等被發(fā)現(xiàn)可以平衡破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞來(lái)調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收。

前期研究發(fā)現(xiàn)SEMA3B-AS1可以抑制hMSC的增殖和骨分化，但是具體機(jī)制需要研究。目前研究lncRNA的手段主要有：① 功能、表型、疾病性相關(guān)研究；②組學(xué)技術(shù)分析研究lncRNA的差異表達(dá)、尋找預(yù)測(cè)新的lncRNA、生物信息分析lncRNA的靶基因；③ 利用互作技術(shù)及質(zhì)譜技術(shù)尋找及驗(yàn)證與lncRNA結(jié)合的RNA及蛋白等。腫瘤等疾病中l(wèi)ncRNA作用機(jī)制的研究有望為疾病的治療尋找到新的靶點(diǎn)。

本研究主要采用蛋白組學(xué)技術(shù)（iTRAQ）研究反義lncRNA-SEMA3B-AS1的作用機(jī)制。部分結(jié)果及分析如下：

研究?jī)?nèi)容及結(jié)果：

1. MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖和茜素紅S染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)SEMA3B-AS1可以抑制細(xì)胞的增殖（a）和向成骨轉(zhuǎn)化（b）。說(shuō)明SEMA3B-AS1具有抑制人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和向成骨分化的功能作用。

圖1. SEMA3B-AS1對(duì)細(xì)胞增殖和成骨分化的影響

2. 上述功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定了SEMA3B-AS1對(duì)人骨髓干細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生了影響。但是SEMA3B-AS1通過(guò)何種途徑發(fā)揮功能呢？

作者接著包裝SEMA3B-AS1過(guò)表達(dá)慢病毒，采用蛋白組學(xué)技術(shù)（iTRAQ）檢測(cè)過(guò)表達(dá)SEMA3B-AS1和空載體的兩個(gè)細(xì)胞組中差異蛋白的變化。通過(guò)對(duì)差異蛋白做了聚類(lèi)和功能富集，發(fā)現(xiàn)SEMA3B-AS1可能通過(guò)上調(diào)或者下調(diào)相關(guān)基因來(lái)影響肌動(dòng)蛋白骨架、黏著斑、胞外基質(zhì)與受體的相互作用，來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨生成，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和分化。

圖2. SEMA3B-AS1過(guò)表達(dá)組和空載體組中差異基因的聚類(lèi)圖

圖3. 功能富集和差異蛋白表達(dá)分析

這樣，整篇文章的思路出來(lái)了。功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SEMA3B-AS1對(duì)細(xì)胞增殖和分化的作用，蛋白組學(xué)技術(shù)研究探討SEMA3B-AS1發(fā)揮作用的可能途徑，由功能到機(jī)制的探討研究。詮釋反義lncRNA（SEMA3B-AS1）可以通過(guò)某些途徑抑制hMSC的增殖和骨分化，為骨質(zhì)疏松的治療提高靶點(diǎn)參考。

研究小結(jié)：

借鑒可取之處：lncRNA分為正義lncRNA和反義lncRNA，同正義lncRNA相比，反義lncRNA由于與正義鏈互補(bǔ)，反義鏈lncRNA與相鄰或者相近的基因的調(diào)控關(guān)系更加密切。首先，作者取道反義lncRNA，以骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制研究為目的，以人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、反義lncRNA（SEMA3B-AS1）為對(duì)象，功能實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SEMA3B-AS1對(duì)細(xì)胞增殖和骨生成的影響。同時(shí)，作者采用蛋白組學(xué)技術(shù)（iTRAQ）檢測(cè)分析受SEMA3B-AS1調(diào)控的蛋白的差異表達(dá)以及差異蛋白的生物學(xué)過(guò)程及相關(guān)的代謝通路。最后，作者分析了SEMA3B-AS1調(diào)節(jié)的骨生成在骨質(zhì)疏松發(fā)生中的作用，得出SEMA3B-AS1可能是骨質(zhì)疏松治療的一個(gè)靶點(diǎn)。

不足遺憾之處：基因選取得比較好，但是文章在組學(xué)上做得比較常規(guī)；雖然做了過(guò)表達(dá)SEMA3B-AS1后相關(guān)的細(xì)胞功能驗(yàn)證，但深度還不夠；其次，本文作者猜測(cè)SEMA3B-AS1可以調(diào)控臨近的SEMA3A(B)的表達(dá)，但可惜沒(méi)有做進(jìn)一步的驗(yàn)證；如果文章作者能夠進(jìn)一步運(yùn)用pulldown或者RIP互作技術(shù)（結(jié)合質(zhì)譜），找出互作分子，文章亮點(diǎn)更足，內(nèi)容更翔實(shí)。

解析文獻(xiàn)：

Chen Zhang, Yun Zhu, et al. SEMA3B-AS1-inhibited osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells revealed by quantitative proteomics analysis. journal of cellular physiology, DOI: 10.1002/jcp.26776.

參考文獻(xiàn)：

[1] J.C. Chen, C.R. Jacobs, Mechanically induced osteogenic lineage commitment of stem cells, Stem Cell Res Ther, 4 (2013) 107.

[2] J.J. Quinn, H.Y. Chang, Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function, Nat Rev Genet, 17 (2016) 47-62.

[3] C. Sang, Y. Zhang, F. Chen, P. Huang, J. Qi, P. Wang, Q. Zhou, H. Kang, X. Cao, L. Guo, Tumor necrosis factor alpha suppresses osteogenic differentiation of MSCs by inhibiting semaphorin 3B via Wnt/beta-catenin signaling in estrogen-deficiency induced osteoporosis, Bone, 84 (2016) 78-87.

[4] P.S. Mathieu, E.G. Loboa, Cytoskeletal and focal adhesion influences on mesenchymal stem cell shape, mechanical properties, and differentiation down osteogenic, adipogenic, and chondrogenic pathways, Tissue Eng Part B Rev, 18 (2012) 436-444.

1. J.C. Chen, C.R. Jacobs, Mechanically induced osteogenic lineage commitment of stem cells, Stem Cell Res Ther, 4 (2013) 107.

2. J.J. Quinn, H.Y. Chang, Unique features of long non-coding RNA biogenesis and function, Nat Rev Genet, 17 (2016) 47-62.

3. C. Sang, Y. Zhang, F. et al , Tumor necrosis factor alpha suppresses osteogenic differentiation of MSCs by inhibiting semaphorin 3B via Wnt/beta-catenin signaling in estrogen-deficiency induced osteoporosis, Bone, 84 (2016) 78-87.

4. P.S. Mathieu, E.G. Loboa, Cytoskeletal and focal adhesion influences on mesenchymal stem cell shape, mechanical properties, and differentiation down osteogenic, adipogenic, and chondrogenic pathways, Tissue Eng Part B Rev, 18 (2012) 436-444.

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