題目：Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation

蛋白質組學聯合代謝組學分析哺乳動物細胞從靜止到增殖的生物過程表征

期刊：Cell Reports

影響因子：8.032

主要技術：蛋白質組學、代謝組學

 

研究背景

        正常增殖細胞和腫瘤細胞之間在代謝過程和生理功能上既有相似性又有差異性。在細胞周期中，代謝過程會隨著細胞周期的變化而發生改變，但是目前對其發生機制并不清楚。

 

研究結果

1. 細胞增殖周期不同階段的蛋白表達變化

        作者選擇響應IL-3的非惡性鼠pro-B淋巴細胞系FL5.12為研究對象。其中，對照組細胞系在不含IL-3的培養基中培養36小時，實驗組細胞系在靜止期維持36h后，培養基中加入IL-3刺激細胞增殖，收集不同時期的細胞，以備進行蛋白質組學分析和代謝組學分析（圖1）。

圖1 收集細胞增殖不同階段細胞樣品

 

        作者選用TMT技術對收集到的不同時期的細胞進行蛋白質組學分析，共定量到6700個蛋白質，其中超過4700個蛋白質在兩次生物學重復中均鑒定到，平行性較好的蛋白共2666個，這些重復性好的蛋白質是后續分析的重點。對以上蛋白的聚類分析發現，隨著細胞周期進程，蛋白質總體表達趨勢呈現逐步的變化。全局表達模式產生兩個不同的時間簇，對應于從G0到G1（0h和4h）的過渡階段和從G1到G2/M（8h到20h）的過渡階段（圖2）。有兩組蛋白質具有相反的表達模式，其中一組在G0 / G1中上調，在S / M / G2中下調，另一組則表現出相反的表達模式。隨后挑選差異變化大，且跟細胞周期進程有關的60個關鍵蛋白進行表達趨勢聚類分析，結果表明這些蛋白參與到細胞的增殖過程。作者進一步進行GO富集分析，結果顯示在參與核仁、線粒體、核糖體的結構成分、ATP結合、翻譯起始因子活性、翻譯和rRNA加工（p值<0.001）的蛋白在進入細胞周期時大多上調。這表明蛋白質合成相關蛋白在FL5.12細胞由靜止到響應IL-3的增殖轉變過程中起重要作用，這與先前關于進入第一細胞周期的T細胞活化的研究一致。

圖2 蛋白表達層次聚類分析

 

2. 細胞增殖周期不同階段的蛋白模塊分析

         為了進一步加深對細胞周期生理調節的研究，作者通過系統編譯已知和預測的蛋白質模塊建立了一個大型小鼠蛋白質模塊庫，借助COMPLEAT tool分析蛋白質組學TMT數據并生成蛋白模塊的時間表達譜，對每個階段的protein modules（功能一致的蛋白歸屬于同一個protein modules）進行打分和p值分析，找到每個階段重要protein modules及其參與的生物學過程（圖3）。作者使用多個過濾標準對protein modules進行優先級排序（圖3B-E），找到了311個有文獻支持的protein modules。作者觀察到，在G0時期有4個protein module的TCA cycle中的蛋白表達下調，這跟腫瘤細胞線粒體代謝抑制、糖酵解活躍的代謝特征較為類似，同時也促使作者研究與癌癥相關的其他代謝途徑以及個體代謝酶。

        作者挑選了8種關鍵代謝途徑（TCA cycle、 glycolysis、 de novo pyrimidine biosynthesis、de novo purine biosynthesis、pyrimidine salvage、purine degradation、lipid synthesis、 the urea cycle）進行深入研究，發現TCA循環的下調受到電子傳遞鏈（ETC）復合物組分蛋白的整體下調支持，而糖酵解中蛋白恰恰相反，葡萄糖轉運抑制劑Txnip被下調，葡萄糖轉運蛋白Slc2a1（Glut1）在G0 / G1期轉變期間被上調（圖4）。

圖3 protein modules分析

 

 

圖4 TCA循環中下調蛋白和糖酵解中上調蛋白

 

3. 代謝物水平與代謝酶的相關性

        作者更感興趣的是代謝酶的表達量趨勢變化是否反映在它們的代謝產物中。所以，作者又進行了代謝組學分析，6個時間點檢測到291種代謝物，最后篩選過濾后得到155種代謝物用于后續分析。層次聚類分析顯示代謝組學表達譜在相鄰時間點之間是相似的，而且不同于蛋白質組學結果，在G0/G1的轉變過程中變化非常顯著，代謝組表達量變化出現在S期（T = 12h以后）。作者進一步要驗證相關代謝物的表達水平是否與代謝酶的表達水平一致，將可信度高的代謝物映射到上述8個代謝通路中。結果顯示絕大多數酶顯示出一致的模式，但對于它們的代謝物而言則不如此，代謝物的波動也大于酶水平，如在TCA循環中始終下調的酶顯示出可變的代謝物模式（圖4A-B），在G0-G1過渡期間，一些代謝物如檸檬酸鹽、異檸檬酸鹽、α-酮戊二酸鹽、富馬酸鹽和蘋果酸鹽上調。總而言之，如TCA、糖酵解、脂質代謝通路中，代謝酶的表達與相關代謝產物的表達變化趨勢并不是非常一致。而有些代謝物，如核苷酸代謝途徑，由于該通路比較細化，和參與該通路的酶有比較好的相關性。

        為了解釋酶和代謝物的相對豐度的變化，作者首先獲得平均酶和代謝物時間曲線（圖5A），TCA循環、糖酵解和脂質合成顯示酶與相應代謝物水平之間沒有明顯的相關性，而其他途徑顯示正相關或負相關。為了更好地量化這些關系，作者計算了酶豐度譜和代謝物豐度譜之間的絕對Pearson相關系數以及它們在代謝途徑中的每一種里面的平均值，然后對于每個途徑，通過酶和代謝物的隨機取樣對平均值進行統計顯著性檢驗。除TCA循環和糖酵解（p值> 0.4）外，酶和代謝物譜之間的相關性總體上好于預期的偶然性（p值<0.09）。對于相關性低的酶和代謝物，最可能的解釋是，這些途徑中的代謝物也被其他途徑中的酶作用。相反，核苷酸代謝中的代謝物更受限于其特定途徑，因此表現出較好相關性。

        作者又繼續研究一種途徑中酶譜與另一種途徑中代謝物譜之間的交叉相關性，以了解相互關系（圖5B）。作者發現TCA循環中的酶和尿素循環中代謝物正相關，而與糖酵解和TCA循環中的代謝物負相關；糖酵解和TCA循環中的代謝物和嘧啶/嘌呤合成途徑中的酶正相關。糖酵解途徑中的酶與其他通路的相關性要高于糖酵解通路本身，意味著糖酵解的代謝產物是其他途徑如氨基酸和核苷酸合成途徑的合成前體。因此作者認為代謝物動力學顯示出比酶動力學更復雜的模式。

圖5 酶和代謝物的相關性分析

研究結果

        正常增殖細胞和腫瘤細胞之間在代謝和生理上存在相似和不同。一旦細胞進入細胞周期，細胞代謝用于促進各種生物過程。為了將代謝與細胞周期相關聯，作者分析了響應于IL-3的非惡性鼠pro-B淋巴細胞系的從靜止到增殖的轉變，發現了正常增殖細胞與癌細胞共有的多個關鍵通路代謝酶表達趨勢，并且細胞增殖轉變的許多代謝特征可見于癌細胞。其研究結果可以就癌癥代謝的治療窗口進行深入研究。

 

解析文獻

Ho-Joon Lee , Mark P. Jedrychowski,et al. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports , 2017 , 20 (3) :721-736.

 

參考文獻

1. Ting L, Rad R, Gygi SP, Haas W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nature methods. 2011; 8:937–940.

2. Orr SJ, Boutz DR, et al. Proteomic and protein interaction network analysis of human T lymphocytes during cell-cycle entry. Molecular systems biology. 2012; 8:573.

3. Singh SA, Winter D, et al. Co-regulation proteomics reveals substrates and mechanisms of APC/C-dependent degradation. The EMBO journal. 2014; 33:385–399.

4. Coloff JL, Murphy JP, et al. Differential Glutamate Metabolism in Proliferating and Quiescent Mammary Epithelial Cells. Cell Metab. 2016; 23:867–880.