相比于基因組包含的全部基因，人類蛋白質組包含了更多的功能性多肽，部分歸因于，翻譯的同時和翻譯后的蛋白修飾。蛋白質組學研究的目的是獲得存在于特定的細胞或組織類型，和存在于健康或患病組織的功能蛋白質的全貌。蛋白質組學研究的重要領域之一，是識別那些翻譯后修飾的蛋白質，及其修飾位點，確定修飾的功能以及在細胞功能網絡中修飾蛋白的相互作用。

 

        在過去的幾十年，開發了多種方法測定蛋白質修飾。在這里，我們重點介紹識別蛋白質修飾的一般方法，質譜；識別磷酸化的特異性方法，磷酸鹽標記；識別泛素化的方法；在染色質重塑過程中識別組蛋白乙酰化和甲基化的方法；識別蛋白質糖基化的方法。

修飾	功能	檢測
磷酸化	細胞內信號轉導	質譜 放射性測量分析 磷酸化特異抗體的免疫印跡
泛素化	蛋白質降解	質譜 泛素化檢測
質譜	轉錄的調控	染色質免疫沉淀 ChIP-on-chip
泛素化檢測	細胞外信號轉導	質譜 高效液相色譜法

表：蛋白質修飾的類型，其主要的細胞功能，和主要的研究方法。

 

蛋白質修飾

質譜

        在過去20年來，質譜分析已成為確定蛋白質修飾類型和位點的必不可少的工具。質譜分析可用于純化的蛋白質或蛋白質的混合物，例如細胞裂解液。

質譜儀從蛋白樣品產生氣相離子，根據質荷比(m/z) 將其分開，并記錄其豐度。質譜可用于多肽和蛋白質的分子量測定，多肽氨基酸序列的確定，和翻譯后修飾的檢測，以及多肽和蛋白質的相對定量。這種方法不能用于絕對定量。

        質譜分析的樣品制備，用限制性內切酶如胰蛋白酶把蛋白質或裂解液消化成小分子多肽片段。然后蒸發和分析這些多肽片段，以確定其m/z值。由于酶切位點是已知的，所以就可以用計算機程序，根據質量確定每個肽段的特定氨基酸序列。由于磷酸基等分子的分子量和電荷是已知的，所以也可以檢測肽段中特定氨基酸的磷酸化。

        基質輔助激光解吸/電離(MALDI)肽圖譜或納升電質譜儀可以分析酶解消化的蛋白質樣品。然而這些方法的局限是不能完全檢測所有多肽片段，有些肽段清晰可見，有些肽段不可見。這對于復雜混合物的分析通常是一個主要問題，對于修飾肽段和翻譯后修飾的分析，先用反相色譜分離多肽，然后餾分收集和用質譜分析(LC/MS)。為了更準確地確定肽段修飾的性質，經常用串聯質譜(MS/MS)實驗。第一個MS步驟后，用惰性氣體撞擊多肽離子，從而導致進一步的碎片化。然后在第二個MS步驟分析這些多肽片段。在此過程中，有些修飾肽段將保持不變，產生的肽段模式類似于中未相撞的肽段，有些肽段將顯著碎片化，產生的肽段模式可以為修飾氨基酸的性質和位點提供進一步的信息。

        除了被用來確定單一蛋白質的修飾狀態，質譜還被用來確定帶有某種特定修飾如磷酸化的所有蛋白質的廣泛數據集。這通常涉及到質譜分析前的親和層析。這種技術被用于確定帶有這種修飾的‘次級蛋白質組’，例如磷酸化蛋白質組分析癌癥中整個信號網絡的激活狀態。

質譜法已被用來確定上述所有四種修飾。然而，質譜分析較為昂貴，需要特定的設備，通常需要更多的定量數據，所以質譜分析通常是結合其他生化方法用于分析蛋白質的翻譯后修飾。

 

磷酸化

        磷酸化，或絲氨酸，蘇氨酸或酪氨酸殘基增加一個磷酸基團，是蛋白質修飾最常見的形式之一。在細胞內的信號轉導通路，蛋白質磷酸化起著重要的作用，是可逆的，微調的信號 [7] 。幾種體內的和體外的方法，被用于檢測蛋白質的磷酸化狀態，檢測一個特定氨基酸的磷酸化，以及確定一個特定的激酶（或磷酸酶）是否作用于目標蛋白質。

通過抗體分析的蛋白磷酸化檢測

 

體外磷酸化分析

        放射測量激酶反應使用32P-gamma-ATP，可用于檢測體外磷酸化狀態。這也是檢測特定激酶作用的金標準。在反應緩沖液中，溫育純化的靶蛋白，激酶，和32P-gamma-ATP。然后，反應液用濾膜過濾，蛋白質結合到濾膜，洗去未結合的ATP，用閃爍計數器檢測磷酸化水平（保留在濾膜的放射性同位素）。或者，反應液用SDS-PAGE電泳分析，用X射線膠片暴光觀察。這種方法是半定量，但可以確定磷酸化蛋白的分子量。

        同樣，反應可以包括磷酸酶，而不是激酶，以確定磷酸化的蛋白是否是一種特定的磷酸酶的底物。

 

放射性脈沖標記

        為了檢測磷酸化體內,可以使用放射性脈沖標記。細胞生長于32P-正磷酸鹽存在的條件下。然后用特定抗體免疫沉淀某種蛋白質，沉淀得到的放射性同位素，用閃爍計數器定量或SDS-PAGE電泳分析和X射線膠片暴光。這種方法可以在各種生理條件下檢測磷酸化。此外，與蛋白質敲除實驗相結合，這種方法也可用來分析一個特定的激酶或磷酸酶是否影響靶蛋白的修飾狀態。

 

磷酸化特異性抗體

        磷酸化特異性抗體有兩種類別。第一類是通用的 磷酸化酪氨酸，磷酸化絲氨酸，磷酸化蘇氨酸抗體，將結合于任何磷酸化酪氨酸，磷酸化絲氨酸和磷酸化蘇氨酸分子，與鄰近的氨基酸殘基無關。第二類包括的抗體是磷酸化特定氨基酸表位抗體。

        用計算機方法或用質譜法識別了（假定）的磷酸化位點之后，可以從公司購買針對磷酸化位點的通用抗體，通過免疫沉淀的步驟，以確定目標蛋白質是否在特定類型的位點被磷酸化（例如一個典型的cyclin/cdk位點）。也可以使用針對一個特定的磷酸化氨基酸，如磷酸化酪氨酸，制備的抗體。接下來，針對特定表位制備磷酸化抗體，通過簡單的免疫印跡檢測磷酸化。為了分析大量的樣品，可以用酶聯免疫吸附試驗，目標蛋白結合到膜上，然后用磷酸化特異抗體檢測。

 

泛素化

        蛋白質泛素化，或靶蛋白共價結合泛素，在蛋白質降解中的研究最深入。例如，泛素介導的蛋白質降解被證明在細胞周期的運轉中發揮了至關重要的作用。然而，最近的研究也發現了在多個不關乎蛋白質降解的細胞內信號轉導通路中泛素的作用。

        泛素介導的信號轉導的多樣性是取決于目標蛋白可以通過多種方式被泛素修飾 - 在一個或多個位點的單泛素化，和通過幾種可能鍵合的多泛素化。每一個泛素分子有七個可能的賴氨酸殘基可用于泛素鏈的延伸; 因此多泛素化的功用取決于泛素鏈延伸中所用的賴氨酸殘基。而這是由特異的E2（泛素結合酶）或E3（泛素連接酶）確定的，但是E1（泛素激活酶）沒有特異性。特異賴氨酸鍵合的多泛素鏈生成了獨特的結合表面，與特定相互作用蛋白的泛素結合域相吻合。

        泛素化的檢測方法可以識別特定賴氨酸殘基的泛素化或確認特異的E3（或E2）是否在靶蛋白的修飾上發揮了作用。檢測泛素化體內的最直截了當和常用的方法是免疫沉淀認定的泛素化蛋白，然后SDS-PAGE/免疫印跡，觀察泛素化蛋白典型的梯狀。往往通過異位表達靶蛋白，E3連接酶，甚至泛素，以確定突變的影響。蛋白酶體降解的抑制劑，如MG132，通常被用來分析體內靶蛋白的 K48泛素化（降解錨定）。

        體外泛素化檢測（提供靶蛋白，泛素，E1，E2，和E3），結合SDS-PAGE，接著蛋白質印跡，可以被用來更直接地檢測目標蛋白的泛素化。目標蛋白中賴氨酸殘基的突變實驗，可以被用來確定泛素的結合位點。相反，在多泛素化的情況下，泛素中特定的賴氨酸殘基的突變實驗，可以被用來確定特異的泛素鍵合方式。為了發現新的泛素化蛋白，可以進行泛素介導的蛋白質純化，然后質譜分析。

 

 

乙酰化和甲基化

        保守的核心組蛋白H2A，H2B，H3，和H4的表觀遺傳修飾（如磷酸化，泛素化，乙酰化和甲基化）在基因表達中發揮重要的調節作用。例如，組蛋白尾部N-末端賴氨酸殘基的乙酰化和甲基化介導染色質域的形成，如，常染色質和異染色質，從而直接介導基因沉默。檢測核心組蛋白的修飾狀態，是分析基因表達調控的重要技術。

 

修飾的組蛋白抗體和ChIP

        所有已知的組蛋白修飾位點的抗體都可以從公司購買。可以使用這些抗體，進行染色質免疫沉淀(ChIP)實驗。簡言之，交聯劑如甲醛處理細胞或組織樣本，組蛋白交聯到染色質。超聲或核酸酶處理染色質，產生短的DNA片斷。然后用針對組蛋白特定修飾的抗體，進行免疫沉淀（IP）的實驗步驟。如果目標基因或啟動子中假定的組蛋白修飾位點是已知的，那么PCR就可以對組蛋白某個位點的特定修飾進行定量。另外，這種方法可以用來確定通用啟動子區域內的組蛋白修飾位點，以及組蛋白某個位點的修飾動力學。

核心組蛋白的乙酰化和甲基化可以通過染色質的免疫沉淀確定

 

糖基化

        在所有的蛋白質中，將近50％的蛋白被糖基化，或結合多種糖基，在多種多樣的生物過程中，從胚胎發育，細胞分裂，到蛋白質結構調控，糖基化都發揮作用。在正常的生理活動和疾病（例如炎癥，敗血癥和癌癥）過程中，多種不同蛋白質的糖基化狀態發生顯著變化。因此，檢測蛋白質糖基化的實驗，有助于疾病預后和治療目的的研究。

蛋白糖基化的兩個主要類型是N-糖基化（聚糖結合到天冬酰胺）和O-糖基化（聚糖結合到絲氨酸或蘇氨酸）。不同于以上討論的蛋白修飾，糖基化修飾的聚糖種類繁多。蛋白糖基化分析的目的是確定聚糖基，被修飾的蛋白質，或結合的位點。在一般情況下，糖基化分析，可以使用三種不同的方法，化學或酶解后對釋放的聚糖本身的分析，胰蛋白酶消化后對糖肽的定性，或完整的糖蛋白中對聚糖的定性。

 

聚糖分析

        聚糖分析，可以用質譜分析，有時并用高效液相色譜法。糖蛋白首先經過酶（肽N糖苷酶A或F）或化學（hydazinolysis）方法釋放糖基。 然后LC/MS直接分析釋放的低聚糖。或者，酶或化學裂解產生可以還原型末端被標上熒光標記，然后通過一些可能的HPLC方法，如親水作用色譜，分析熒光標記的聚糖。

糖蛋白鑒定

        雖然上述方法能提供特定聚糖的信息，但是這些信息不能鑒定出帶有特定修飾的蛋白質，也不能鑒定出糖基化的結合位點。為了獲得此信息，就要進行蛋白內切酶裂解（如胰蛋白酶消化），LC/MS或HILIC-MS/MS分析糖肽。這種方法提供的信息是帶有特定聚糖分子的所有蛋白質，或者是目標蛋白中聚糖的結合位點。

糖基化可通過質譜測定，以確定特定的修飾聚糖

       最后，對于有些糖肽，完整蛋白的質譜分析可以提供蛋白質的身份鑒定及其糖基化狀態的數據。然而，這種方法取決于糖肽的生化特性，提供的數據的分辨率水平通常低于前述兩種方法。