常規(guī)抗體

        常規(guī)的抗體或者是完整大小的抗體是被稱為免疫球蛋白的糖蛋白，是漿細(xì)胞對(duì)外來(lái)分子或者抗原反應(yīng)后產(chǎn)生的。抗體最基礎(chǔ)的功能是結(jié)合特異性抗原并激發(fā)免疫反應(yīng)，從而保護(hù)機(jī)體免于感染。抗體包括好幾種亞型，這里主要是介紹IgG和IgM亞型的抗體。IgG和IgM亞型的抗體被廣泛應(yīng)用于科研、診斷和治療等方面。

 

1.常規(guī)抗體的結(jié)構(gòu)

        一個(gè)完整的抗體的基礎(chǔ)單元結(jié)構(gòu)有四條肽鏈組成，包括兩條重鏈和兩條輕鏈，并通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。抗體的形狀像一個(gè)Y字母，Y結(jié)構(gòu)的鉸鏈區(qū)具有彈性。每條肽鏈就有一個(gè)恒定區(qū)（在所有的抗體中都非常的保守）和一條可變區(qū)（在一個(gè)種抗體中都是特異性的）。輕鏈可變區(qū)的標(biāo)示符號(hào)是VL，而輕鏈恒定區(qū)的標(biāo)示符號(hào)是CL（圖一左）。 類似的，重鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)分別被標(biāo)示為（VH）和（CH）。碳水化合物通常和重鏈的CH2區(qū)域結(jié)合。Fc段只包括重鏈的恒定區(qū)（CH）, 但是和抗原結(jié)合的Fab段（Fab）包括一個(gè)恒定區(qū)和重鏈的可變區(qū)以及輕鏈的可變區(qū)（VH and VL）。 Fv區(qū)域（variable fragment） 只包含兩個(gè)可變區(qū)

一個(gè)完整的常規(guī)抗體（左）和通常的抗體片段（右）的基本結(jié)構(gòu)

 

2.常規(guī)抗體的應(yīng)用

        常規(guī)抗體在科研中用于通過(guò)蛋白質(zhì)印跡、免疫組織化學(xué)以及酶聯(lián)免疫吸附法等方法檢測(cè)目的蛋白已經(jīng)有幾十年了。完整大小的抗體還被應(yīng)用于臨床的檢測(cè)，比如妊娠試驗(yàn)以及用ELISA檢測(cè)血液中HIV病毒。另外，常規(guī)的完整的抗體還被應(yīng)用于疾病的治療。例如，英利昔單抗是一個(gè)可以識(shí)別腫瘤壞死因子的抗體，被用于治療腸道疾病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。 曲妥珠單抗或者赫賽汀是一種可以結(jié)合上皮生長(zhǎng)因子二的抗體，被用于治療轉(zhuǎn)移的乳腺癌。 另外，還有好多抗體，包括Muromomab，被用于器官移植后的基礎(chǔ)治療來(lái)防止發(fā)生移植物排斥反應(yīng)。

        用常規(guī)抗體的優(yōu)點(diǎn)包括Fc區(qū)域能夠激活機(jī)體的免疫反應(yīng)并結(jié)合到目標(biāo)分子上使之被破壞。用完整抗體的缺點(diǎn)包括由于其分子太大不能被滲入到某些組織中。 Fc段能夠激活一些有害于病人的免疫反應(yīng)是臨床上應(yīng)用完整抗體治療的一個(gè)缺點(diǎn)。Fc區(qū)域通常能引起一些非特異性的結(jié)合，對(duì)抗體的檢測(cè)的應(yīng)用不利。

 

 

抗體片段

        一個(gè)抗體的片段可以通過(guò)化學(xué)試劑和基因工程的方法獲得。化學(xué)試劑片段通過(guò)是通過(guò)打斷鉸鏈區(qū)的二硫鍵或者是用蛋白酶，包括胃蛋白酶和木瓜蛋白酶，消化抗體后產(chǎn)生的。基因工程產(chǎn)生的片段提供大量的片段，每一個(gè)都能有特異性的結(jié)合區(qū)和功能特質(zhì)。

 

Fab, Fab', (Fab')2, 和 Fv

        抗體經(jīng)過(guò)化學(xué)試劑處理的和蛋白酶消化可以得到抗原結(jié)合片段（Fab）, 其來(lái)源于IgG 和 IgM 亞型抗體的可變區(qū)。 去掉Fabs片段的抗體部分就是Fc片段了，由重鏈的恒定區(qū)組成。 抗原結(jié)合片段包括了Fab, Fab', (Fab')2, 和 Fv。 這些片段能夠結(jié)合抗原，但是它們?nèi)鄙貴c段，其包括重鏈的恒定區(qū)2和3。當(dāng)抗體被木瓜蛋白酶消化后，兩個(gè)獨(dú)立的F(ab)片段從Fc區(qū)域分離下來(lái)。然而用胃蛋白酶消化后，一個(gè)帶有小部分的Fc鉸鏈區(qū)的 F(ab')2 片段從抗體中分離下來(lái)。盡管利用化學(xué)試劑的方法分離抗體的片段能夠產(chǎn)生很多有用的診斷和治療的工具，但是是非常費(fèi)時(shí)的而且需要大量的抗體作為原材料。

        單價(jià)的F(ab) 片段只有一個(gè)抗原結(jié)合區(qū)，然而多價(jià)的F(ab')2 片段有兩個(gè)抗原結(jié)合區(qū)，它們通過(guò)二硫鍵結(jié)合在一起。F(ab')2 片段產(chǎn)生2個(gè)單價(jià)的Fab' 片段和一個(gè)游離的硫基，其能夠用于其他分子的結(jié)合。

        Fv 片段是IgG和IgM類型抗體通過(guò)酶法分析后產(chǎn)物中最小的片段。Fv片段抗原結(jié)合區(qū)，其由VH和VC區(qū)域組成，但是他們?nèi)鄙貱H1和CL區(qū)域(Figure 1 right panel)。VH 和VL 通過(guò)非共價(jià)鍵在Fv 片段里結(jié)合在一起。

 

ScFv, 雙特異抗體，三特異抗體，四特異抗體，雙-scFv，mimi抗體，F(xiàn)ab2，F(xiàn)ab3

        基因工程方法能夠產(chǎn)生單鏈可變區(qū)（ScFv），它是Fv類型片段，其包括了通過(guò)易彎曲多肽鏈接在一起的VH和VL區(qū)域（圖一右）。如果結(jié)合區(qū)至少有12個(gè)殘基的長(zhǎng)度，ScFv片段就是單抗。 通過(guò)操作V-結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)的長(zhǎng)度可以創(chuàng)作不同形式的Fv分子。 連接體是3-11殘基的產(chǎn)生的scFv分子不能折疊成有功能的Fv結(jié)構(gòu)域。這些分子和其他的scFv分子一起可以創(chuàng)作出一個(gè)雙價(jià)的雙特異性抗體。 如果連接體的長(zhǎng)度小于3個(gè)殘基，scFv 分子相互作用后能夠產(chǎn)生三特異性或者四特異性抗體。多價(jià)的scFvs與對(duì)應(yīng)的單價(jià)的抗體相比具有更強(qiáng)的結(jié)合抗原的親和力。 Mini抗體是scFv-CH3融合蛋白，被裝進(jìn)到雙價(jià)的二聚體中。 Bis-scFv 片段是雙特異性的。 小型化的ScFv片段能夠通過(guò)兩個(gè)不同的可變區(qū)產(chǎn)生，能夠讓這些Bis-scFv分子同時(shí)結(jié)合兩個(gè)不能的表位。基因?qū)W方法能夠用來(lái)產(chǎn)生雙特異性的Fab 二聚體（Fab2）和三特異性的Fab 三聚體（Fab3）。這些抗體片段同時(shí)能夠結(jié)合2 （Fab2）或者3（Fab3）不同的抗體。

 

駱駝/鯊魚(yú)源抗體和納米抗體

        除常規(guī)抗體外，駱駝科動(dòng)物和鯊魚(yú)還含有一些特殊的重鏈抗體（hcAb），它們完全由缺乏輕鏈的重鏈同源二聚體組成。這些抗體的Fab部分稱為VHH（重鏈抗體的可變結(jié)構(gòu)域），是天然發(fā)現(xiàn)的最小的抗原結(jié)合區(qū)域。納米抗體是VHH衍生的重組結(jié)構(gòu)域且能結(jié)合抗原。它們非常穩(wěn)定，可以很容易地通過(guò)傳統(tǒng)的簡(jiǎn)單系統(tǒng)大量生產(chǎn)，如細(xì)菌（但具有輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體難以在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)），因此是一種對(duì)研究和治療應(yīng)用有前景的工具，特別是在超分辨顯微鏡，質(zhì)譜和靶向蛋白質(zhì)降解領(lǐng)域。納米抗體可以通過(guò)與多肽共價(jià)連接被遞送到活細(xì)胞內(nèi)，或者直接在體內(nèi)表達(dá)并識(shí)別靶點(diǎn)，但同時(shí)具有輕鏈和重鏈的常規(guī)抗體不能用于活細(xì)胞。例如，抗GFP納米抗體用于開(kāi)發(fā)研究體內(nèi)神經(jīng)元活性的電磁控制系統(tǒng)。抗RFP或GFP的納米抗體與遠(yuǎn)紅染料Atto結(jié)合時(shí)，可以獲得超過(guò)GFP或RFP 118倍的熒光信號(hào)放大，可用于產(chǎn)生全身小鼠神經(jīng)元連接。它們還可在結(jié)構(gòu)研究中用來(lái)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)。現(xiàn)已證明，AAV表達(dá)載體能生產(chǎn)通用流感疫苗，這個(gè)載體有抗四種不同流感病毒株的連鎖納米抗體。重組抗小鼠和抗兔IgG二級(jí)納米抗體有可能取代廣泛使用的多克隆二抗。納米抗體具有跨越血腦屏障的獨(dú)特能力; 然而，往往會(huì)很快被處理和清除出體外。納米抗體可用于一些特定目的，如（共）免疫沉淀或活細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)的實(shí)時(shí)熒光蛋白示蹤。

 

牛超長(zhǎng)CDR3H

        大約10％的牛免疫球蛋白包含一個(gè)具有多個(gè)半胱氨酸殘基的長(zhǎng)CDR3H區(qū)域，這種長(zhǎng)莖結(jié)構(gòu)被認(rèn)為有助于抗體多樣性。

 

抗體片段的應(yīng)用

        在一些應(yīng)用中，片段比完整的抗體更加有優(yōu)越性。這個(gè)話題最近被Nelson寫(xiě)了綜述。 其中一個(gè)優(yōu)越性是片段比完整的抗體要小，能夠進(jìn)入完整抗體進(jìn)不去的組織中發(fā)揮治療作用和進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 抗體片段比常規(guī)的抗體更小，通常沒(méi)有被糖基化，可以使它們的產(chǎn)物在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，從而節(jié)省時(shí)間和資金消耗。然而， 缺少Fc結(jié)構(gòu)域的片段在體內(nèi)比常規(guī)抗體降解的速度要快，而且不能夠激發(fā)Fc介導(dǎo)的細(xì)胞毒性進(jìn)程，除非它們結(jié)合一個(gè)為了達(dá)到更好治療目的的有效的原件。然而，缺少Fc結(jié)構(gòu)域?qū)τ诿庖呓M織化學(xué)和其他的檢測(cè)又是有利的，因?yàn)闇p少了抗體與Fc受體的非特異性結(jié)合。沒(méi)有Fc區(qū)域的抗體片段具有能夠減少非特異性結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。抗流感的神經(jīng)氨酸酶抗體 NC10 是一個(gè)在診斷中被廣泛應(yīng)用的一個(gè)ScFv。抗上皮細(xì)胞粘附分子Ep-CAM抗體MOC-31 是一個(gè)用于癌癥治療的ScFv。 雙特異性抗體，三特異性抗體和四特異性抗體在放射免疫治療和體內(nèi)的影像學(xué)診斷方面都有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

        盡管各種抗體片段具有某些優(yōu)點(diǎn)，但它們通常不用于實(shí)驗(yàn)。在截止2016年3月來(lái)邦網(wǎng)調(diào)研的38430篇文獻(xiàn)中，只有少數(shù)文章與抗體Fab片段的應(yīng)用有關(guān)。Roche抗地高辛配基Fab片段在原位雜交實(shí)驗(yàn)中以1:1000或1:2000稀釋使用，結(jié)果表明主要的近端肢體細(xì)分取決于可擴(kuò)散信號(hào)，纖毛發(fā)生由進(jìn)化組裝的順式調(diào)節(jié)元件調(diào)控，蝴蝶中的模擬翼模式進(jìn)化可由optix基因調(diào)控。他們還用來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)折疊分析，通過(guò)單分子力譜以研究單個(gè)鈣調(diào)蛋白分子折疊的過(guò)程。 Roche抗地高辛配基抗體在綿羊中產(chǎn)生并通過(guò)木瓜蛋白酶消化生產(chǎn)。Roche抗熒光素堿性磷酸酶Fab片段用來(lái)進(jìn)行Southern印跡以研究拓?fù)洚悩?gòu)酶II的功能。Roche抗地高辛配基或抗熒光素Fab試劑的最新研究實(shí)例包括，描述神經(jīng)元表達(dá)的連接蛋白35b的表達(dá)模式，討論果蠅胚胎，卵巢和培養(yǎng)細(xì)胞系中凋亡性細(xì)胞死亡的方法，測(cè)試突觸GluA2濃度是否能夠調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)運(yùn)輸或局部翻譯，研究人類皮質(zhì)形成與受損的音猬信號(hào)傳導(dǎo)之間的關(guān)系，研究發(fā)育過(guò)程中時(shí)鐘基因表達(dá)行波的機(jī)制，研究TRF2與核纖層蛋白A/C之間的相互作用如何調(diào)控染色體結(jié)構(gòu)，描述一種連接小鼠神經(jīng)元特定亞型的發(fā)育途徑的檢查方法及其它應(yīng)用。

        來(lái)自Invitrogen公司的Alexa 546共價(jià)結(jié)合的驢抗兔IgG Fab片段，用在免疫組化實(shí)驗(yàn)中來(lái)研究sFLT-1在維持小鼠模型中無(wú)血管感光細(xì)胞層中的作用。該公司的Alexa Fluor 488兔抗山羊IgG（H+L）（Fab'）2片段，被用在免疫組化實(shí)驗(yàn)中來(lái)研究聽(tīng)覺(jué)毛細(xì)胞中尖端連接再生的機(jī)制。

 

Fc片段受體

        Fc受體（FcR）是主要在先天免疫細(xì)胞上/中表達(dá)的分子，能識(shí)別并結(jié)合抗體的Fc結(jié)構(gòu)域，從而為它們提供細(xì)胞系統(tǒng)以引發(fā)免疫應(yīng)答。FcR的多種功能反映了抗體廣泛的保護(hù)或調(diào)控作用，包括介導(dǎo)靶向底物的中和和清除以及適應(yīng)性免疫的編程。FcR的生物學(xué)功能受基于免疫受體酪氨酸的活化基序（ITAM）和基于免疫受體酪氨酸的抑制基序（ITIM）的調(diào)控，分別作為激活和抑制信號(hào)傳導(dǎo)途徑的受體界面。因此，ITAMs的信號(hào)傳導(dǎo)可以引發(fā)細(xì)胞活化，吞噬和內(nèi)吞作用，而ITIMs的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)細(xì)胞活化具有抑制作用。現(xiàn)已有關(guān)于所有類別的免疫球蛋白的FcR的描述，下面將對(duì)其中一些進(jìn)行討論。

 

IgG受體

        該家族包括FcγRI，F(xiàn)cγRII，F(xiàn)cγRIII及其亞型。它們負(fù)責(zé)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用（ACDP）。

另一種結(jié)合IgG的受體是新生兒Fc受體（FcRn），其參與從母體到胎兒的被動(dòng)體液免疫的轉(zhuǎn)移。FcRn還可以保護(hù)IgG免于體內(nèi)降解，這是它們?cè)谘逯械陌胨テ陂L(zhǎng)的原因。通過(guò)Fc區(qū)的改變以促進(jìn)Fc-FcRn相互作用，該現(xiàn)象產(chǎn)生了更好的治療性抗體的開(kāi)發(fā)。

 

IgE受體

        它們包括能夠結(jié)合單體IgE的高親和力FcεRI和能夠優(yōu)先與IgE復(fù)合物相互作用的低親和力C型凝集素FcεRII。FcεRI通過(guò)刺激細(xì)胞脫粒和在肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞上釋放一系列炎癥介質(zhì)來(lái)介導(dǎo)許多過(guò)敏反應(yīng)的即時(shí)超敏應(yīng)答。FcεRII既能以膜結(jié)合形式存在用于遞送下調(diào)IgE合成的信號(hào)，又能以可溶性片段形式存在產(chǎn)生上調(diào)效應(yīng)。它在人類氣道和腸上皮細(xì)胞中IgE過(guò)敏原復(fù)合物胞吞過(guò)程中的作用正在被積極地研究，可能是治療食物過(guò)敏引起的過(guò)敏性氣道炎癥的潛在靶點(diǎn)。

 

IgA受體

        FcαRI是該類型的唯一成員，僅在骨髓譜系細(xì)胞中表達(dá)。根據(jù)IgA結(jié)合狀態(tài)，它在促炎癥和抗炎癥反應(yīng)中起作用。雖然結(jié)合于粘膜部位的分泌型IgA（SIgA）具有抗炎作用，包括預(yù)防病原體入侵，血清IgA的結(jié)合導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。 FcαRI還根據(jù)炎癥微環(huán)境調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞活力。

 

TRIM21

        TRIM21顯示出非常廣泛的抗體特異性，因而可以與其他FcR區(qū)分開(kāi)。它可以結(jié)合IgG，IgM和IgA。此外，它在大多數(shù)產(chǎn)生組織的細(xì)胞中表達(dá)。TRIM2通過(guò)靶向細(xì)胞溶質(zhì)病毒-抗體復(fù)合物進(jìn)行蛋白酶體降解，參與抗體介導(dǎo)的病毒復(fù)制干擾。

        Fc結(jié)構(gòu)域與FcR的結(jié)合可能在基于單克隆抗體的分析方法中具有負(fù)面效果，例如免疫組織化學(xué)（IHC），流式細(xì)胞術(shù)（FACS）和染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）。與FcR的非特異性結(jié)合可能引入背景噪聲，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性。該問(wèn)題的解決方案包括使用（i）用于門(mén)控的同種型對(duì)照，（ii）血清來(lái)廣泛競(jìng)爭(zhēng)參與非特異性結(jié)合的受體，或（iii）純化的IgG以特異性阻斷Fc受體。Innovex 的Fc受體阻斷劑＃NB309可在IHC或IC實(shí)驗(yàn)中用于阻斷石蠟或冷凍切片BD Biosciences＃553142可用于流式細(xì)胞術(shù)。