上一期我們簡要介紹了circRNA的生物學(xué)功能等，今天，我們接著談circRNA。既然確認(rèn)走circRNA這條摸索的路，又為了斬獲得國自然基金和高分文章，那小編就根據(jù)近幾年circRNA研究熱點，梳理出常規(guī)的科研思路和推薦相應(yīng)的經(jīng)典文獻，供君詳閱。

 

研究思路

1. 探究circRNA的第一步：找尋circRNA

        首先是尋找差異表達的circRNA。通過微陣列分析細(xì)胞系中circRNAs的表達譜，尋找一些顯著表達的circRNAs，或通過高通量測序或芯片結(jié)合RT-qPCR驗證篩選出感興趣的circRNA，包含二代測序建庫和RNA深度生物信息學(xué)分析。

        其次是進行初步的細(xì)胞功能驗證。若源于臨床樣本，在驗證組織樣本表達差異后，再通過生存曲線、凋亡分析、裸鼠成瘤實驗等驗證與表型變化一致，或構(gòu)建circRNA系列表達載體，制備特異性檢測circRNA翻譯蛋白的抗體進行細(xì)胞功能驗證。

 

2. 探究circRNA的第二步：摸索功能機制

按照circRNA三大研究熱點進行細(xì)分，梳理對應(yīng)的科研思路：

（1）circRNA作為miRNA海綿的研究思路

        circRNA結(jié)合miRNA的靶點預(yù)測。通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測circRNA中miRNA潛在結(jié)合位點，可采用Arraystar miRNA軟件進行初步篩選，再按照DIANA數(shù)據(jù)庫定向篩選。

ceRNA機制驗證。通過螢光素酶報告基因確定miRNA可以直接靶向circRNA的3′UTR；RT-qPCR和RIP實驗證實circRNA的miRNA sponge功能；RNA FISH實驗輔助確認(rèn)circRNA主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；敲除和共轉(zhuǎn)染實驗驗證ceRNA機制。

        經(jīng)典文獻推薦：此類研究依舊熱門，2018年6月發(fā)表在Journal of Hepatology（IF=14.911）上的一篇名為“Circular RNA cSMARCA5 inhibits growth and metastasis in hepatocellular carcinoma”的研究，揭示了circRNA cSMARCA5在肝癌的發(fā)生發(fā)展中的機制。

（2）circRNA參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究思路

        circRNA翻譯蛋白質(zhì)進行細(xì)胞功能驗證。生存曲線、凋亡驗證與表型變化的一致性，也可通過基因敲除/過表達探究circRNA的翻譯功能。

        circRNA翻譯蛋白質(zhì)的分子機制。進行分子機制研究，揭示生命的深層次奧秘，為人類的健康事業(yè)做出貢獻。

        經(jīng)典文獻推薦：此類研究比較新穎，2018年3月發(fā)表在Journal of the National Cancer Institute（IF=11.238）上的一篇名為“Novel role of FBXW7 circular RNA in repressing glioma tumorigenesis”的研究，揭示了circRNA-FBXW7在內(nèi)部核糖體進入位點驅(qū)動下跨接開放閱讀框編碼一種新的21kDa蛋白，以及其在抑制膠質(zhì)瘤腫瘤發(fā)生中的新作用。

（3）circRNA參與蛋白結(jié)合的研究思路

        探究circRNA與結(jié)合蛋白（RBP）的互作。通過RIP或計算機模擬實驗篩選出與circRNA相互作用的蛋白，并研究兩者的調(diào)控關(guān)系或下游機制。

        經(jīng)典文獻推薦：此類研究思路簡明，2017年3月發(fā)表在Theranostics（IF= 8.537）上的一篇名為 “A circular RNA binds to and activates AKT phosphorylation and nuclear localization reducing apoptosis and rnhancing cardiac repair”的研究，揭示了circRNA結(jié)合并激活A(yù)kt磷酸化和核定位，發(fā)揮減少細(xì)胞凋亡并增強心臟修復(fù)的作用。

 

3. 探究circRNA的第三步：驗證和升華

        通常是構(gòu)建動物模型或追溯臨床標(biāo)本信息，開展體內(nèi)驗證實驗，幫助升華circRNA在疾病治療中研究意義。

 

circRNA常用數(shù)據(jù)庫

        我們身邊中總有大咖大牛出沒，常能羅列出很多串聯(lián)的線索，與其退而慕之，不如臨淵而漁。推薦使用在線數(shù)據(jù)庫如下，可幫助探索和挖掘更多有用的circRNA信息。

1. circRNADb，網(wǎng)址：http://reprod.njmu.edu.cn/circrnadb，是首個匯總可編碼蛋白的環(huán)狀RNA數(shù)據(jù)庫，共收集了32914條人類外顯子環(huán)狀RNA記錄，每條記錄都包括基因組位置信息、RNA編輯情況、所對應(yīng)的基因組序列、IRES序列元件、預(yù)測ORF以及相關(guān)的參考文獻。

2. circRNABase，網(wǎng)址：http://starbase.sysu.edu.cn/，是專門為circRNAs和CLIP-SEQ（HITS-CLIP，PAR-CLIP，iCLIP，CLASH）數(shù)據(jù)集進行解碼miRNA-circRNA相互作用網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫。

3. circlncRNAnet ，網(wǎng)址：http://app.cgu.edu.tw/circlnc/，是整合lncRNA和circRNA的功能網(wǎng)絡(luò)的在線分析數(shù)據(jù)庫，主要是集合了TCGA數(shù)據(jù)庫20多個腫瘤類型數(shù)據(jù)，無需編程即可實現(xiàn)在線可視化分析，而且分析模板非常豐富，另外用戶也可提交lncRNA和circRNA芯片或測序的表達數(shù)據(jù)進行自行分析。

        值得注意的是，一般通過RNA深度測序結(jié)合軟件分析來預(yù)測circRNA（常用軟件有MapSplice、CIRCexplorer、CIRI、CircBase等）或lncRNA（常用軟件有PLEK、 CPAT、CNCI、lncScore等）的假陽性較高，需要通過實驗進一步驗證。

 

文獻分享

題目：Circular RNA BCRC-3 suppresses bladder cancer proliferation through miR-182-5p/p27 axis

期刊：Mol Cancer

影響因子：7.776

        本文作者分析了人體組織circRNA高通量測序結(jié)果，確定了膀胱癌相關(guān)circRNA-3 ，包括BCRC-3, GenBank: KU921434.1，作為PSMD1基因的候選circRNA。通過qRT-PCR、RNA pulldown、螢光素酶報告基因等技術(shù)驗證了BCRC-3與mRNA的相互作用。發(fā)現(xiàn)BCRC-3在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達較低，體內(nèi)外BCRC-3過表達抑制了BC細(xì)胞增殖。值得注意的是，BCRC-3可以直接與miR-182-5p相互作用，作為miRNA海綿促進p27的miR-182-5p靶向3'UTR活性。因此，BCRC-3可作為腫瘤抑制劑，通過miR-182-5p/p27抑制BC細(xì)胞增殖。

 

題目：Discovery of Kaposi's sarcoma herpesvirus-encoded circular RNAs and a human antiviral circular RNA

期刊：Proc Natl Acad Sci USA

影響因子：9.504

 

        非編碼RNA在宿主-病毒相互作用中具有重要作用，circRNA是一種單鏈非編碼RNA，可誘騙RNA或RNA結(jié)合蛋白抑制其功能。在卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV)中，circRNA的作用未知。本文作者用不同的PCR引物和RNase R處理特異性circRNA表明，hsa_circ_0001400是一種感染誘導(dǎo)的circRNA，其過表達抑制了KSHV新生感染中病毒基因LANA和裂解基因RTA的表達。接著，作者使用KSHV感染細(xì)胞且經(jīng)過RNase R處理的circRNA進行了circRNA-Seq分析，鑒定到了由KSHV基因組編碼的多個circRNA，它們在KSHV感染的內(nèi)皮細(xì)胞和原發(fā)性滲出淋巴瘤(PEL)細(xì)胞中表達。作者還發(fā)現(xiàn)，KSHV circRNA位于病毒裂解基因的ORF內(nèi)。作者揭示了宿主-病毒相互作用circRNA—人類抗病毒circRNA，它在KSHV感染時被激活，在感染裂解階段被誘導(dǎo)表達。

 

題目：Novel Role of FBXW7 Circular RNA in Repressing Glioma Tumorigenesis

期刊：Journal of the National Cancer Institute

影響因子：11.238

        作者通過對腦膠質(zhì)瘤臨床組織標(biāo)本進行circRNA測序及生物信息分析，發(fā)現(xiàn)了腦組織及癌旁組織中有明顯差異表達的circRNA，重點關(guān)注了抑癌基因FBXW7第3、4個外顯子環(huán)化后形成的一個circRNA，并命名為circ-FBXW7。隨后作者發(fā)現(xiàn)circ-FBXW7存在高度保守的內(nèi)部核糖體插入序列（IRES），并通過實驗證實了circ-FBXW7翻譯了一個大約21KD的蛋白質(zhì)，并命名為FBXW7-185aa。通過常規(guī)的細(xì)胞功能學(xué)實驗，作者發(fā)現(xiàn)circ-FBXW7翻譯的蛋白質(zhì)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增值。接著作者進一步證實了FBXW7-185aa協(xié)調(diào)母基因FBXW7產(chǎn)生的蛋白一起調(diào)控原癌基因c-Myc的穩(wěn)定性。最后作者對腦膠質(zhì)瘤臨床組織標(biāo)本進行檢測，統(tǒng)計臨床關(guān)聯(lián)性，做了小鼠腦部原位成瘤實驗。發(fā)現(xiàn)人類細(xì)胞中circ-FBXW7可以翻譯一個新的蛋白，對膠質(zhì)瘤有抑制作用并對膠質(zhì)瘤患者的臨床預(yù)后有關(guān)聯(lián)性。

 

題目：Circular non-coding RNA ANRIL modulates ribosomal RNA maturation and atherosclerosis in humans

期刊：Nature Communications

影響因子：12.353

 

        環(huán)狀RNA在真核細(xì)胞中是廣泛表達的，但是其于人類疾病的關(guān)系還不清楚。本文作者發(fā)現(xiàn)circANRIL（circular antisense non-coding RNA in the INK4 locus）可以通過抑制rRNA的成熟，促進細(xì)胞的凋亡，抑制增殖，激活p53通路，達到防止動脈粥樣硬化的作用。由于circANRIL來源的lncRNA有結(jié)合蛋白的作用，所以作者用Label-free檢測了與circANRIL結(jié)合的蛋白譜。富集分析發(fā)現(xiàn)circANRIL pull-down下來的蛋白主要在核糖體RNA的形成和RNA剪切上。然后作者從顯著富集的蛋白中選擇了幾個與核糖體剪切相關(guān)的蛋白，做RIP驗證，發(fā)現(xiàn)circANRIL可以與rRNA前體競爭結(jié)合PES1蛋白，從而使rRNA前體在細(xì)胞內(nèi)聚集，細(xì)胞壓力增加，引起核仁碎裂，p53的激活，細(xì)胞凋亡。