GST Pull-Down實驗基于GST(glutathione-S-transferase),即谷胱甘肽-S-轉移酶蛋白，可以與谷胱甘肽(Glutathione,GSH)結合,將GSH固定于磁珠上,形成GSH-磁珠,將已知蛋白X與GST融合表達,獲得的GST-X蛋白可與GSH-磁珠結合，若體系中存在與X蛋白互做的蛋白Y,則會形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”復合物,與X蛋白互做的蛋白即可被分離并檢測。

通過pull-down后WB驗證發現,雖然可見目的條帶,但是背景很高:

多方面原因造成:

1)實驗儀器或試劑被污染,使用潔凈的儀器及試劑。

2)轉移膜上的目特異吸附導致背景高,實驗操作過程中載手套,使用鑷子來取,不要接觸膜轉移面。

3)制備樣品中可能有不完全溶釋的大的蛋白復合體,則在制備樣品后進行知暫超聲處理(3次,每次5秒鐘),然后離心,取上清后進行后續試驗。

4)洗滌不徹底,則需要多次洗滌,并設新增加洗滌液中的NaCl和去垢劑濃度。

5)使用了過多的細胞或組織進行裂解導致背景高,則須減少樣本量,推薦100-500ug細胞裂
解物。

6) 蛋白降解也可能出現高背景的情況,盡量使用新鮮制備的樣品。

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