染色體免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是用來研究蛋白質(zhì)與DNA是否在體內(nèi)存在相互作用,這項技術(shù)幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。利用抗體抗原特異性結(jié)合,將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來,能夠真實地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。

Q1:怎么探索超聲條件

1)接觸式超聲儀:取2mLEP管,加入1.4mL液體,將探頭置于EP管中心,液面下約一半的位置,設(shè)置超聲時間為10S,逐漸增加功率,直至開始起泡,此時功率為超聲最大功率。在此基礎(chǔ)上設(shè)置三個不 同的功率梯度和時間梯度進行探索。

2)非接觸式:可按廠家推薦進行探索。

Q2:超聲后片段不符合要求

1)有符合要求的片段也有比較集中無法超聲的大片段,可能是交聯(lián)溫度過高,交聯(lián)時始終保持溫度低于25℃,尤其是夏天溫度較高可將試劑和樣本放置空調(diào)出風(fēng)口一段時間再進行操作。

2)片段很集中且小于200bp,超聲功率和時間不合適,需要做預(yù)實驗探索最佳超聲條件。

Q3:IP和IgG樣本Ct值沒有差異

1)抗體沒有富集到DNA,可更換抗體嘗試。

2)lgG背景過高,可增加洗滌次數(shù)或減少免疫沉淀步驟DNA投入量。

3) 結(jié)合位點預(yù)測錯誤,需重新設(shè)計引物。

Q4:溶解曲線異常

溶解曲線非單一峰,可能為非特異擴增或有引物二聚體等情況,需重新設(shè)計引物。

Q5:樣本DNA濃度很低,低于10ng/μL

1)樣本投入量過少:考慮增加樣本初始投入量,尤其是肌肉,心臟等。

2)裂解不完全:樣本過度交聯(lián)或研磨不充分。

3) 如遇難裂解樣本可在加入LysisBuffer后-80℃急速冷凍,37°C解凍,反復(fù)凍融3次。

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