實驗原理
酵母核體系雙雜交技術是基于對真核細胞轉錄因子特別是酵母轉錄因子GAL4性質的研究，GAL4包括兩個結構域，即DNA結合結構域(DNA-binding domain，BD)和轉錄激活結構域(Activating domain,AD)。BD能夠識別位于GAL4效應基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)并與之結合，AD可以啟動UAS下游的基因進行轉錄。BD和AD分別單獨作用并不能激活轉錄，但是當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性并可激活UAS下游啟動子，轉錄啟動子下游基因并使其表達。
Y2HGold菌株是GAL4系統酵母雙雜實驗用菌株，可直接轉化質粒進行蛋白互作驗證。Y2HGold-GAL4酵母雙雜系統需要兩種質粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。質粒pGBKT7的篩選標志為TRP1，用于表達BD(來自酵母轉錄因子GAL4 N端1~174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白;質粒pGADT7的篩選標志為LEU，用于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白(Prey)的融合蛋白。本試劑盒提供的產品包含了酵母雙雜驗證過程中用到的各種培養基以及酵母轉化試劑，操作簡單，能用于10對雙雜的互作驗證(質粒需自行擴繁)。
產品優勢
1.采用多個篩選步驟，可以減少非特異性相互作用的假陽性結果。
2.每個環節均有嚴格的質控，實驗效率更高。
3.可處理復雜樣本，同時篩選和鑒定多個蛋白質間的相互作用，實現高通量的篩選和分析。
4.使用操作簡便，更易上手。
5.性價比高:試劑配套齊全，價格優惠，低于市面上同款產品。
實驗流程
結果展示
稀釋點種驗證
1：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7 ]（自激活）
2：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7-B ]（實驗組）
+：Y2H[pGBKT7-53 + pGADT7-T]（陽性對照組）
-：Y2H[pGBKT7-lam + pGADT7-T]（陰性對照組）
常見問題與解答
Ql:酵母雜交發生假陽性的原因及解決方式?
產生原因:
(1)由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用，或者其激活作用被外來蛋白激活。
(2)AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結合，也可以單獨激活報告基因的表達。
(3)BD和AD在文庫中會有隨機碰撞導致空間上的接近，以致下游報告基因的表達。
解決方法:
(1)對于點對點驗證來說，可同時將誘餌和獵物進行自激活驗證，減少假陽性的判定，但是一旦誘餌和獵物均產生自激活，后續自激活的處理方式(截短)會浪費較多的時間;
(2)由于每個報告基因上游的調控區各不相同，因此用不同的報告基因驗證陽性，可用于排除或減少假陽性，這也是我們主要采取的方式;
(3)單雜啟動子，我們主要采用將報告基因整合到酵母的染色體上，可以使基因表達水平穩定，消除了由于質?？截悢底兓鸬幕虮磉_水平的波動而造成的假陽性。
Q2:如果誘餌可以直接激活報告基因，該如何處理?
為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3’AT/ABA進行背景抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有較大的毒性，后續可能會影響文庫篩選，因此在3'AT超過15mM，ABA超過1200ng/mL時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷，通過查閱文獻和相關數據庫，截去轉錄激活的區域，但是需要注意的是，截去的這一部分很有可能會影響到互作結果。
Q3:如何從驗證結果判斷兩個蛋白是否互作及互作強度?
酵母核雙雜點對點驗證是根據是否激活3個報告基因(MELI、HIS、Ade2)來反推是否有互作，是否激活了報告基因又是根據涂布相應平板的顏色反應及菌落有無及大小來判斷，因此我們可以直接根據顯藍的強弱、TDO上斑的多少以及大小、QDO上是否能生長來初步判斷互作的強弱。
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