膜體系酵母雙雜是基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導的膜蛋白酵母雙雜交系統，該系統可用于膜蛋白-膜蛋白或膜蛋白-胞質蛋白之間的互作檢測。
泛素是一種含76個氨基酸的保守蛋白，它經常作為降解信號連接在蛋白質的N端。泛素能被其特異性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)識別并從所連接的蛋白上切割下來，切割位點總是位于泛素蛋白的C端。在酵母細胞中，泛素可以分成兩部分單獨表達，即其N端部分(NubI,第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub,第35~76位氨基酸)，后者融合有能啟動核內報告基因表達的LexA-VP16蛋白。

野生型NubI和Cub具有高親和力，并且可以自發重組形成異源二聚體。但是當野生型NubI的第13位Ile被Ala或Gly取代后，NubI和Cub就不能自發結合，因此，NubG(I13G)和Cub-LexA-VP16只有依靠bait和prey相互作用進行連接形成完整的泛素分子，然后誘導UBPs識別并于其C端進行剪切，從而釋放出轉錄因子LexA-VP16，最終啟動核內報告基因(HIS3、ADE2、LacZ)的轉錄。

1.采用多個篩選步驟，可以減少非特異性相互作用的假陽性結果。
2.每個環節均有嚴格的質控，實驗效率更高。
3.可處理復雜樣本，同時篩選和鑒定多個蛋白質間的相互作用，實現高通量的篩選和分析。
4.使用操作簡便，更易上手。
5.性價比高: 試劑配套齊全，價格優惠，低于市面上同款產品。

稀釋點種驗證

1：pBT3-A和pPR3-N（自激活）

2：pBT3-A和pOst1-NubI（功能驗證）

3：pBT3-A和pPR3-N-B（實驗組）

+：pTSU2-APP和pNubG-Fe65（陽性對照組）

-：pTSU2-APP和pPR3-N（陰性對照組）

Q1:膜體系為什么要做功能驗證?怎樣進行功能驗證?
膜系統載體的選擇主要根據誘餌跨膜的類型進行選擇，為驗證誘餌載體是否構建正確，能在細胞中形成正常的功能，需要將重組誘餌質粒和獵物載體pOST1-NubI共轉化酵母菌株中，通過涂布缺陷型和報告基因平板，如果均生長，說明誘餌和獵物的功能域形成了完整的泛素，激活了報告基因的表達，誘餌構建無誤，能夠形成正常的定位和功能。

Q2:用篩出的陽性結果做點對點驗證現陰性結果的原因是什么?
(1)酵母雜交本身也是存在假陽性的情況，有可能這兩個基因根本不互作，合成全長進行驗證自然也不會產生互作;
(2)對于雙雜來說一般是兩個結構域之間的互作，如果互作的兩個基因的結構域恰好處于接觸的狀態，那么就可以發生相互作用;
(3)有些互作為瞬時互作，在文庫篩選時可能捕捉導了互作，而在兩個基因進行單獨驗證時就顯示為陰性;
(4)有些互作為間接互作，可能需要依靠第三個基因的作用，促進這兩個基因的互作;
(5)有些蛋白在正天然情況下可能為膜蛋白或者是定位在膜上的蛋白，酵母雜交雖然是模擬體內互作，但是與天然狀態下的蛋白還是有一定的差距的，為保證兩個蛋白在同一空間，誘餌和獵物載體均帶有核定位信號，會強行的將他們定位在核內，因此可能會產生假陽性的情況。

Q3:篩出的陽性結果為什么需要重新合成全長而不是片段做回轉驗證?
(1)片段的序列是基于測序結果得出來的，可能會有突變和缺失的情況，可能不是一個完整的結構域;
(2)將陽性測序結果進行NCBI數據庫檢索時，由于為片段式可能會匹配到很多的基因，沒有辦法確定為哪一個基因，需要進行試驗確認才能定位到具體的基因，在進行后續的輔助實驗EMSA，pulldown等實驗時才有理論依據，否則在發文章時僅憑不能確定基因的片段并不能作為有力的支撐。

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