酵母膜體系文庫構(gòu)建試劑盒，提供了一種從總RNA或者polyA+RNA獲得高質(zhì)量全長cDNA文庫的方法。本試劑盒在基于分高的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)上，通過對pPR3-N序列載體進(jìn)行改造，額外增加了三框文庫的構(gòu)建。本產(chǎn)品適用于從100~500μg不同來源的真核生物總RNA中，經(jīng)過mRNA分離、單鏈cDNA合成、雙鏈cDNA合成、雙鏈cDNA分選、小量連接轉(zhuǎn)化、大量連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建獲得高質(zhì)量的酵母cDNA文庫。該試劑盒提供的試劑可以用來構(gòu)建5個(gè)cDNA文庫

金開瑞根據(jù)誘餌蛋白的定位自主研發(fā)了核蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒、核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒及膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒。相較于市面上其他的同款產(chǎn)品，本試劑盒針對建庫質(zhì)量做了以下優(yōu)化:
1、升級反轉(zhuǎn)錄酶:顯著增加了熱穩(wěn)定性和半衰期，提高cDNA合成效率和片段完整性。
2、改造pPR3-N載體:創(chuàng)新的三框文庫構(gòu)建方法，可保證片段長度、陽性率和文庫滴度等信息的一致性。
3、引入CCDB自殺基因:極大降低了空載的產(chǎn)生，基本實(shí)現(xiàn)100%陽性率。
4、DH10B:經(jīng)過了高抗性壓力篩選，提高文庫轉(zhuǎn)化率。
5、超高性價(jià)比:提供全套必需試劑，無需額外購買，簡化實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備工作。

實(shí)驗(yàn)時(shí)間表

酵?膜體系?庫構(gòu)建：文庫插入片段PCR鑒定80%在750bp以上，文庫的陽性率>90%

＋：以pPR3-N為模板

－：以水為模板

Q1:對于核體系酵母文庫和膜體系酵母文庫，該如何選擇試劑盒?
對于亞細(xì)胞定位顯示定位在細(xì)胞核的蛋白，選擇膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒;對于定位在細(xì)胞膜的蛋白，則選擇核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒;對于定位在細(xì)胞質(zhì)的蛋白，可以選擇核/膜蛋白酵母雙雜交建庫試劑盒。

Q2:核體系酵母文庫和膜體系酵母文庫在構(gòu)建上有什么區(qū)別?
核體系酵母文庫是基于GAL4酵母單雙雜的系統(tǒng)，通過對PGADT7序列載體進(jìn)行改造，而膜體系文庫是在基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)上，通過對pPR3-N序列載體進(jìn)行改造。兩款試劑盒使用的載體不同，但實(shí)驗(yàn)方法幾乎都是一致的。

Q3:雙鏈cDNA跑膠條帶小于預(yù)期大小
使用的總RNA或者mRNA存在降解、樣品不純、濃度太低等問題，可以通過以下方法解決:
(1)通過瓊脂糖凝膠檢測總RNA和mRNA的質(zhì)量，確保質(zhì)里和純度均沒有問題(如果RNA質(zhì)量很好，但濃度太低，則使用更多的RNA來進(jìn)行雙鏈的合成;如果RNA質(zhì)量不行，則需要重新提取RNA);
(2)對RNA的穩(wěn)定性進(jìn)行檢測，如果RNA容易降解，檢查所用的離心管、tip頭等是否有RNase的污染，并換一種方法重新提取總RNA;
(3)為了更容易地確定是否是RNA的問題，請使用對照RNA進(jìn)行平行反應(yīng)。

Q4:如何檢測文庫質(zhì)量，文庫容量低應(yīng)該怎么解決?
對于我們提供的大腸桿菌文庫甘油菌，可以進(jìn)行梯度稀釋后鋪板培養(yǎng)，第二天計(jì)算庫容量，同時(shí)挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以判斷插入片段長度和空載率。如果檢測出文庫容量低，有可能是連接效率低，可以通過以下兩種方式解決問題:
(1)檢查分級分離后雙鏈cDNA的濃度，雙鏈cDNA的濃度應(yīng)該在100~200 ng/uL的濃度范圍內(nèi);
(2)按照試劑盒說明書中的連接體系，連接體系中線性化載體和雙鏈產(chǎn)物的配比不合適，或者連接體系中這兩者所加入的里太多均會影響連接效率。

Q5:雙鏈cDNA產(chǎn)物中存在較多<0.1Kb的條帶?
可能是PCR的循環(huán)數(shù)太多了，重新使用第一鏈產(chǎn)物進(jìn)行第二鏈的合成PCR時(shí)減少3~4個(gè)循環(huán)數(shù)。

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