RNA pull-down是研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白/RNA結(jié)合情況的技術(shù)。先將RNA進(jìn)行標(biāo)記(如生物素標(biāo)記),再與細(xì)胞裂解液共同孵育,從而形成RNA-RNA/蛋白質(zhì)復(fù)合物,進(jìn)而檢測(cè)與之結(jié)合的RNA或蛋白質(zhì)。復(fù)合物洗脫后,通過熒光定量PCR(RNA pull down-QPCR)或高通量測(cè)序(RNA pull down-seq)方法來鑒定目標(biāo)RNA是否與某些RNA分子相互作用,通過Western blot(pull down-WB)實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜(pull down-
MS)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)RNA是否與某些蛋白相互作用。

Q1: 實(shí)驗(yàn)全程如何預(yù)防RNA降解？

實(shí)驗(yàn)使用的所有試劑耗材需經(jīng)過去RNA酶處理。

Q2：RNA pull-down?定要體外轉(zhuǎn)錄合成RNA探針嗎？

體外轉(zhuǎn)錄只是獲得RNA的?種?式，相比化學(xué)合成純度更高。所以pull-down實(shí)驗(yàn)?般是體外轉(zhuǎn)錄得到目的RNA。當(dāng)目的RNA序列大于2000bp時(shí)體外轉(zhuǎn)錄就不太容易轉(zhuǎn)錄成功，這時(shí)我們可以設(shè)計(jì)合成?小段目的RNA探針，通過探針與目的RNA結(jié)合，再與蛋白結(jié)合，便可繞過這個(gè)問題。

Q3：RNA在轉(zhuǎn)錄出來后，其OD?般都不高，可以使用嗎？如何定量呢？

OD值不高可進(jìn)行RNA純化，即便不純化在實(shí)驗(yàn)中多加?些RNA亦可。而定量問題?般會(huì)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可以根據(jù)marker濃度來判斷RNA的濃度。也可以用儀器測(cè)量RNA的濃度，但通過體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA濃度都能達(dá)到2μg/uL以上。并且pull-down實(shí)驗(yàn)不需要精確的定量，都會(huì)加入過量的探針。

Q4：關(guān)于樣本處理，細(xì)胞或者組織裂解時(shí)要不要加蛋白酶抑制劑或RNA酶抑制劑？還需要進(jìn)行其他處理嗎？操作過程中需要注意什么？

細(xì)胞裂解需要加?蛋白酶和RNA酶抑制劑，最好能夠進(jìn)行超聲處理。另外裂解蛋白的全程盡量在冰上操作。

Q5：lncRNA引物設(shè)計(jì)有什么注意事項(xiàng)？或者說與普通的引物設(shè)計(jì)有什么區(qū)別？

體外轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的引物只需要在正向引物5’端加?T7啟動(dòng)子序列即可。

Q6：質(zhì)譜鑒定的蛋白主要是依據(jù)打分來進(jìn)行篩選？這個(gè)篩選多少分算有效？

pull-down富集蛋白質(zhì)譜分析后會(huì)剔除不可信蛋白，交付的都是可信蛋白，沒有明確的打分。需要排序的話?般是根據(jù)鑒定蛋白特征性肽段的數(shù)目作為參考。

Q7：做lncRNApull down+質(zhì)譜?般都會(huì)發(fā)現(xiàn)多個(gè)互作蛋白對(duì)嗎？如何選擇哪一種蛋白繼續(xù)研究下去？

不同的RNA結(jié)合蛋白數(shù)量不等，根據(jù)實(shí)際鑒定的蛋白進(jìn)行篩選；篩選的原則是根據(jù)自己研究的方向或相關(guān)功能確定這類蛋白。