DNA pulldown
- DNA-蛋白質(zhì)相互作用
- 基因調(diào)控
- DNA修復(fù)
- 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能
服務(wù)特色
DNA pull-down技術(shù)是研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用和調(diào)控的有力工具，有助于揭示基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、信號傳導(dǎo)途徑和疾病機(jī)制等方面的重要信息。
服務(wù)介紹
DNA pull down是用于分析蛋白質(zhì)與DNA互作的一種分析技術(shù)。一般來說，該實(shí)驗(yàn)首先需要針對待研究目的基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計并制備特異性探針（以脫硫生物素標(biāo)記為主流）；同時，制備細(xì)胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結(jié)合蛋白就會和靶向序列特異性結(jié)合；然后，通過親和素磁珠純化蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物；最后針對獲得的蛋白，使用WB驗(yàn)證或者質(zhì)譜方式鑒定蛋白質(zhì)類型。
服務(wù)優(yōu)勢
- 高特異性：能夠高度特異地富集與目標(biāo)DNA序列相互作用的蛋白質(zhì)，具有較低的背景干擾
- 可定量分析：可對DNA-蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行定量分析，如熒光或放射性標(biāo)記的探針，可測量結(jié)合的強(qiáng)度和親和力
- 適用于高通量分析：DNA pull-down技術(shù)可進(jìn)行高通量分析，同時研究多個DNA-蛋白質(zhì)相互作用，提供更全面的信息和更深入的洞察
- 低樣本量要求：僅需要少量的樣本即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，對于限量樣本或珍貴樣本的研究具有重要意義
- 適用范圍廣泛：可在不同實(shí)驗(yàn)條件下應(yīng)用，包括體外和體內(nèi)研究，適用于各種生物體系和細(xì)胞類型。它可以用于研究不同生物過程中的DNA-蛋白質(zhì)相互作用，例如基因調(diào)控、DNA修復(fù)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能等。無論是研究基礎(chǔ)生物學(xué)還是疾病機(jī)制，DNA pull-down技術(shù)都具有廣泛的適用性
服務(wù)流程
客戶提供
DNA序列相關(guān)信息或DNA過表達(dá)質(zhì)粒
細(xì)胞樣品
如WB檢測則需提供特定蛋白一抗
送樣要求：
1、質(zhì)粒至少提供10ug
2、凍存細(xì)胞兩只或復(fù)蘇細(xì)胞兩瓶
3、動物或植物組織至少500mg
4、細(xì)胞沉淀至少2*10的7次方
注：除了復(fù)蘇細(xì)胞常溫運(yùn)輸以外，其他樣品均干冰運(yùn)輸。
最終交付
- 構(gòu)建含目的基因的質(zhì)粒、菌液，測序報告
- DNA Pull-down蛋白SDS-PAGE銀染圖
- WB檢測報告/質(zhì)譜鑒定分析報告
服務(wù)說明
| 服務(wù)名稱 | 服務(wù)內(nèi)容 | 交付內(nèi)容及標(biāo)準(zhǔn) | 服務(wù)周期(工作日) |
| DNA pull-down | 探針擴(kuò)增回收 | 擴(kuò)增2次 | 16 |
| 蛋白提取+考染 | 1個樣本 | ||
| pull down實(shí)驗(yàn) | 富集2次：IgG、IP各1次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個泳道：IgG、IP、input | 4 | |
| 質(zhì)譜鑒定互作蛋白 | 質(zhì)譜鑒定：IgG、IP | 10-15 |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
EMSA是用特定序列的標(biāo)記探針，同待驗(yàn)證蛋白孵育后進(jìn)行native-PAGE凝膠電泳，如果存在同探針結(jié)合的蛋白，則會出現(xiàn)電泳遷移率明顯低于自由探針的條帶出現(xiàn)。 DNA pull-down是將探針結(jié)合在凝膠/磁珠上，以此收集同該DNA探針發(fā)生互作的蛋白。ChIP實(shí)驗(yàn)中所檢測的DNA-蛋白互作則發(fā)生在活組織細(xì)胞內(nèi)。
相關(guān)技術(shù)服務(wù)
| ? 雙熒光素酶報告系統(tǒng) | ? 修飾/標(biāo)記引物 | ? 酵母雙雜交 |
| ? EMSA | ? RIP-qPCR | ? CoIP |
| ? 酵母單雜交 | ? ChIP-qPCR | ? CUT&Tag |
相關(guān)資源
1、DNA pull-down技術(shù)的實(shí)驗(yàn)步驟
● DNA探針的制備：首先，需要合成或制備與目標(biāo)DNA序列相互作用的探針。探針可以是特定序列的寡核苷酸或DNA片段，可以通過化學(xué)合成或PCR擴(kuò)增等方法獲得。
● DNA探針的修飾：為了方便實(shí)驗(yàn)操作和檢測，DNA探針可以進(jìn)行修飾，如在末端引入標(biāo)記物（如生物素或熒光染料）。
● 蛋白質(zhì)提取：提取目標(biāo)蛋白質(zhì)樣品，可以是細(xì)胞裂解物、組織提取物或純化的蛋白質(zhì)。
● DNA探針的固定：將修飾的DNA探針固定在固相載體上，常用的載體有瓊脂糖珠或磁珠。DNA探針與載體的結(jié)合可以通過生物素-親和素、亞硫酸酯化學(xué)反應(yīng)等方法實(shí)現(xiàn)。
● DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合：將蛋白質(zhì)樣品與固定的DNA探針一起孵育，使其發(fā)生特異性結(jié)合。在孵育過程中，可以添加適當(dāng)?shù)木彌_液和輔助物質(zhì)來維持適宜的條件。
● 洗滌步驟：通過多次洗滌的步驟，去除非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，以增加實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。洗滌條件可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化。
● 蛋白質(zhì)的檢測和分析：通過各種方法，如Western blot、質(zhì)譜分析、熒光檢測等，對結(jié)合到DNA探針的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測和分析。可以使用特異性的抗體來檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在和結(jié)合情況。
● 結(jié)果解讀：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，解讀蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用情況，并進(jìn)一步分析其功能和調(diào)控機(jī)制。
2、DNA pull-down技術(shù)的應(yīng)用
● 基因調(diào)控研究：DNA pull-down技術(shù)可用于研究轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子的結(jié)合，揭示基因調(diào)控機(jī)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。這對于理解基因表達(dá)調(diào)控、發(fā)育過程和疾病發(fā)展等具有重要意義。
● 信號傳導(dǎo)途徑研究：DNA pull-down技術(shù)可以用于研究信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)與DNA的相互作用，如激活因子、抑制因子等，有助于闡明信號傳導(dǎo)機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
● 疾病機(jī)制研究：DNA pull-down技術(shù)可用于研究與疾病相關(guān)的基因突變位點(diǎn)或調(diào)控元件的結(jié)合蛋白，幫助揭示疾病的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制，為疾病的診斷和治療提供理論依據(jù)。
● 藥物開發(fā)與篩選：DNA pull-down技術(shù)可以用于篩選與特定DNA序列結(jié)合的小分子化合物或藥物，幫助尋找新的藥物靶點(diǎn)和開發(fā)潛在的藥物治療方法。
● 比較基因組學(xué)研究：DNA pull-down技術(shù)可用于比較不同物種、不同組織或不同條件下的DNA-蛋白質(zhì)相互作用，幫助理解基因組的進(jìn)化、組織特異性和環(huán)境適應(yīng)等方面的變化。
3、DNA pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果不如預(yù)期如何優(yōu)化
● 問題1：非特異性結(jié)合：蛋白質(zhì)可能與非特定的DNA序列結(jié)合，導(dǎo)致背景信號增加。
優(yōu)化建議：嘗試優(yōu)化DNA探針的設(shè)計，選擇更特異的DNA序列作為探針，以增加結(jié)合的特異性。還可以通過引入競爭性DNA或非特異性DNA序列來減少非特異性結(jié)合。
● 問題2：低信號強(qiáng)度：信號強(qiáng)度較弱，難以檢測目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合。
優(yōu)化建議：優(yōu)化孵育條件，包括孵育時間、溫度和緩沖液的組成。調(diào)整孵育時間可能需要更長的孵育時間，以增加結(jié)合的效率。調(diào)整溫度可以根據(jù)蛋白質(zhì)的最佳結(jié)合溫度進(jìn)行優(yōu)化。此外，優(yōu)化緩沖液的組成，如添加劑或酶抑制劑，可以提高信號強(qiáng)度。
● 問題3：濃度依賴性：蛋白質(zhì)的結(jié)合可能與其濃度相關(guān)，導(dǎo)致信號的變化不確定。
優(yōu)化建議：嘗試不同濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳的濃度范圍，以獲得最強(qiáng)的信號。此外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)部對照來定量分析，以校正信號的變化。
● 問題4：樣本純度不高：樣本中可能存在雜質(zhì)或其他干擾物質(zhì)，影響目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合。
優(yōu)化建議：優(yōu)化樣品處理步驟，如使用高純度的核酸提取方法，減少雜質(zhì)的存在。此外，可以使用特異性抗體進(jìn)行預(yù)處理，以去除非特定結(jié)合的蛋白質(zhì)。
