CO-IP
- 蛋白質復合物鑒定
- 蛋白質相互作用
- 信號傳導研究
- 疾病機制解析
服務特色
Co-IP技術是研究蛋白質相互作用的重要方法之一，通過對蛋白質復合物的免疫沉淀和分析，可以揭示蛋白質相互作用的組成和功能，為理解生物過程和疾病機制提供重要的信息。
服務介紹
免疫共沉淀技術（co-Immunoprecipitation,co-IP）是一種研究兩種蛋白在體內是否存在相互作用的有效方法，通過抗體和已知蛋白結合，從而捕獲整個已知蛋白復合物，進而研究復合物中與已知蛋白存在相互作用的蛋白。
服務優勢
- 直接檢測蛋白質與其他分子（如蛋白質、DNA或RNA）之間的相互作用，提供了定性和定量信息。
- 可以在原生條件下進行，更接近細胞內環境，有助于揭示生物體內的相互作用。
- 可以研究復雜的蛋白質復合物，包括多個亞基或較大的蛋白質復合物。
- 可以通過驗證和功能研究進一步驗證相互作用的生物學功能。
服務流程
客戶提供
1、需檢測的樣品，一抗（也可以選擇由金開瑞提供）。
2、送樣要求：
? 離體后迅速超低溫處理并-80℃凍存的組織樣品，干冰運輸；
? 組織：動物組織不少于400 mg；植物組織不少于2 g；
? 細胞：2x10^7個細胞。
服務說明
| 服務名稱 | 服務內容 | 交付內容及標準 | 服務周期(工作日) |
| 免疫共沉淀Co-IP | 蛋白提取 | 1 個樣本 | 16 |
| Co-IP前wb | 跑膠1個泳道 | ||
| Co-IP | 富集2次：IgG、IP各1次 | ||
| Co-IP后誘餌蛋白wb | 跑膠3個泳道：IgG、IP、input | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個泳道：IgG、IP、input | 4 | |
| 質譜鑒定互作蛋白 | 質譜鑒定：IgG、IP | 10-15 |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）是利用抗原抗體特異性反應純化富集樣品中目的蛋白的一種方法。通常使目標蛋白同抗體-protein A/G形成免疫復合物沉淀而得以收集，然后通過WB檢測目的蛋白。 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CO-IP）是將樣品中同抗體靶蛋白相互作用的蛋白一同隨免疫復合物沉淀，可以檢測兩種目標蛋白質是否在體內存在相互作用，也可以確定一種蛋白在體內的相互作用蛋白。
coIP實驗需要保證足夠的蛋白濃度才能維持原本存在的蛋白互作狀態，尤其當蛋白豐度較低、相互作用力不強、使用不易提蛋白組織等情況時。而且coIP的實驗條件往往需要反復摸索。因此用于coIP實驗需準備細胞＞2x107，動物組織＞500mg，植物組織＞2g，并且須更加注意采集后速凍-80℃保存和避免反復凍融。
a.所使用的抗體不僅需要優秀的親和力、特異性，其識別表位還可能被互作蛋白所掩蔽（主要是使用單抗時）； b.當蛋白互作須發生在特定生理代謝條件、組織細胞類型之中時，coIP實驗可能無法獲得互作結果； c.如果誘餌蛋白和或捕獲蛋白在樣本中豐度很低時； d.兩個互作蛋白的親和力較弱； e.當該蛋白互作需要較特定的離子強度，或者需要如Ca離子/Mg離子/ATP等輔因子時，要創造合適的反應條件會變得困難； f.一些樣品處理提取存在難度，提取足量目的蛋白與保持蛋白天然狀態，需通過實驗條件達到優化平衡； g.外源表達的標簽蛋白存在同內源蛋白的位點競爭，這主要在使用標簽抗體進行實驗時可能存在。
在coIP-WB鑒定結果中，IgG組無目的蛋白條帶、IP組有目的蛋白條帶，說明IP過程成功；銀染膠圖中，IP組相對于IgG組有更多蛋白條帶、且存在差異，說明coIP過程捕獲到互作蛋白；IP產物在質譜檢測中鑒定到的蛋白數量不能作為判斷實驗成敗的標準，因為這取決于目的蛋白本身所具有的互作蛋白數量、結合力強弱等方面；IP產物的質譜鑒定數量越多并不代表結果越好。
相關技術服務
相關資源
1、Co-IP的實驗步驟
● 細胞提取：從細胞或組織中提取蛋白質，可以使用細胞裂解緩沖液來破裂細胞膜，并添加蛋白酶抑制劑和磷酸酯酶抑制劑來保護蛋白質的完整性。
● 抗體固定：將目標蛋白質的抗體與磁珠或瓊脂糖小球等固相材料結合，形成抗體固定的材料。
● 免疫沉淀：將細胞提取物與抗體固定的材料一起孵育，使目標蛋白質與其結合伙伴形成復合物。
● 洗滌：將反應混合物進行多次洗滌，以去除非特異性結合的蛋白質和雜質。
● 洗脫：通過改變pH、離子強度或添加競爭劑等方式，將復合物從抗體固定材料上洗脫下來。
● 蛋白質分析：對洗脫的樣品進行蛋白質分析，可以使用SDS-PAGE和免疫印跡等技術檢測目標蛋白質及其結合伙伴的存在。
2、Co-IP的應用場景
● 揭示蛋白質復合物的組成和功能：Co-IP技術可以用于鑒定蛋白質復合物的組成和結構。通過選擇特定的目標蛋白質作為抗體的靶點，可以將其與其他相互作用蛋白質共沉淀，從而確定蛋白質復合物的組成。這有助于理解蛋白質復合物在細胞內的功能、相互作用網絡和信號傳導通路。
● 研究信號傳導和基因調控：Co-IP技術可用于研究蛋白質在信號傳導和基因調控中的相互作用。例如，可以通過共沉淀實驗來確定轉錄因子與DNA序列的結合，并揭示基因調控的機制。此外，Co-IP還可用于研究蛋白質激酶和底物之間的相互作用，從而了解細胞信號傳導通路的調控機制。
● 鑒定疾病相關的蛋白質復合物：Co-IP技術可用于鑒定與疾病相關的蛋白質復合物。通過將目標蛋白質與疾病相關的樣本共沉淀，可以發現與疾病發生和發展相關的蛋白質相互作用。這有助于理解疾病的發病機制、尋找潛在的治療靶點，并為藥物開發和治療策略提供重要的線索。
● 蛋白質交互作用網絡分析：通過大規模的Co-IP實驗和蛋白質組學技術結合，可以構建蛋白質交互作用網絡圖譜。這些網絡圖譜提供了蛋白質相互作用網絡的全貌，有助于了解細胞內蛋白質相互作用網絡的結構和功能。這對于研究細胞過程、生物學調控和疾病機制等具有重要的意義。
3、與Co-IP技術相關的常見問題與解答
(1) Co-IP實驗中如何選擇合適的抗體？
? 選擇具有高親和力和特異性的抗體，最好是經過驗證的商業抗體或有良好文獻支持的自制抗體。
? 針對目標蛋白質選擇不同的克隆，進行抗體特異性驗證，如Western blotting。
? 進行預實驗，評估抗體的適用性和效果。
(2) 如何優化Co-IP實驗條件以提高效率和特異性？
? 優化提取和溶解條件，使用合適的緩沖液和洗滌液來提高蛋白質的溶解和純化效率。
? 調整孵育時間和溫度，以優化抗體與靶蛋白質的結合。
? 增加洗滌步驟，以去除非特異性結合的蛋白質。
? 使用阻斷劑，如牛血清蛋白（BSA）或魚精蛋白（Gelatin），減少非特異性結合。
(3) 如何解釋Co-IP實驗結果中的負面數據或低信號？
? 檢查實驗條件和步驟是否正確，如蛋白質提取、溶解、抗體結合等。
? 評估抗體的質量和特異性，進行抗體驗證實驗，如Western blotting。
? 重新評估目標蛋白質的表達水平，確定其是否充分表達。
? 檢查Co-IP實驗條件是否適當，可能需要調整抗體濃度、孵育時間等。
