（1）WB（Western Blot ）蛋白免疫印跡雜交 ： 是將蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺電泳按分子量大小分離，再轉(zhuǎn)移到雜交膜（blot）上，然后通過(guò)一抗/二抗復(fù)合物對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性檢測(cè)的方法。 （2）IHC /ICC（Immunohistochemistry/Immunocytochemistry ）免疫組織/細(xì)胞化學(xué)是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理--抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑?（熒光素、酶、金屬離子、同位素）?顯色來(lái)確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對(duì)其進(jìn)行定位、定性及定量的研究 （3）IF （Immunofluorescence ）免疫熒光：是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團(tuán)，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位，以及利用定量技術(shù)（比如流式細(xì)胞儀）測(cè)定含量。 ICC通過(guò)酶反應(yīng)顯色，IF主要測(cè)熒光；用的抗體和識(shí)別的表位是一樣的，做法幾乎一樣。只是標(biāo)記二抗不一樣。

多抗是免疫動(dòng)物后得到的抗血清經(jīng)純化得到的抗體，這些抗體分子識(shí)別抗原的表位不盡相同。 ①?gòu)募兓绞絹?lái)看：采用ProteinA/G純化的多抗摻雜有動(dòng)物本身產(chǎn)生的對(duì)其自身抗原產(chǎn)生的抗體，這些抗體在檢測(cè)中會(huì)識(shí)別樣本中的蛋白而出現(xiàn)雜帶；采用抗原親和純化的多抗只包括識(shí)別免疫原的抗體分子可以避免雜帶的產(chǎn)生； ②從蛋白修飾來(lái)看：天然蛋白存在復(fù)雜的翻譯后修飾。甲基化、乙酰化對(duì)分子量變化影響小，而磷酸化、糖基化、泛素化可能會(huì)使部分蛋白分子量偏大，當(dāng)然也存在翻譯后修飾后條帶變小的情況。 ③從蛋白翻譯后加工來(lái)看：翻譯后蛋白前體經(jīng)切割可能會(huì)使部分蛋白分子量偏小，而天然組織中同時(shí)存在蛋白前體和切割加工后的蛋白，二者序列有相同部分，可能會(huì)產(chǎn)生雜帶。 ④從同源家族蛋白來(lái)看：當(dāng)目的蛋白有同源家族蛋白時(shí)，蛋白異構(gòu)體的存在可能會(huì)使分子量偏離預(yù)測(cè)分子量，因?yàn)樘烊粯颖局杏赏粋€(gè)mRNA不同的剪接方式進(jìn)行翻譯形成的蛋白產(chǎn)物也會(huì)有相同的抗原表位，同時(shí)被抗體識(shí)別時(shí)會(huì)產(chǎn)生雜帶。這點(diǎn)可以通過(guò)信息學(xué)分析進(jìn)行解釋。 ⑤從蛋白聚集形式來(lái)看：蛋白多聚體的形成，雖然還原條件可以抑制多聚體的形成，但是強(qiáng)烈的蛋白間相互作用在還原條件下也有可能不解聚導(dǎo)致條帶偏大。這點(diǎn)需要通過(guò)查閱與目的蛋白相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了解。 ⑥從抗體特異性來(lái)看，如果待測(cè)樣本中有與目標(biāo)蛋白同源性較高的組分，在驗(yàn)證時(shí)也會(huì)出現(xiàn)雜交信號(hào)，其次多克隆抗體是通過(guò)動(dòng)物免疫，制備抗血清進(jìn)而純化得到多抗的，如果免疫宿主本身含有的抗體跟待測(cè)樣本有交叉，同樣也會(huì)出現(xiàn)信號(hào)。 簡(jiǎn)要解釋： a、純化方式，我們目前采用的是ProteinA/G親和純化，純化的多抗也包含了兔子自身的IgG抗體； b、蛋白修飾：天然蛋白存在復(fù)雜的翻譯后修飾，有的甚至?xí)绊憲l帶的大小； c、蛋白翻譯后加工的作用，導(dǎo)致不同剪切體出現(xiàn)，兩者之間若有相同部分，也會(huì)產(chǎn)生雜帶； d、同源家族蛋白的影響； e、蛋白多聚體的影響，雖然還原條件可以抑制多聚體的形成，但也會(huì)有不解聚的情況導(dǎo)致條帶偏大； f、抗體特異性，多抗是通過(guò)動(dòng)物免疫，制備抗血清純化而來(lái)，如果免疫宿主本身含有的抗體跟待測(cè)樣本有交叉，也會(huì)出現(xiàn)雜交信號(hào)。

出現(xiàn)這種情況我們現(xiàn)在的技術(shù)水平很難解釋，我們猜想可能的原因是： ①突變體混入陽(yáng)性樣本； ②生物體樣本發(fā)生基因的代償； ③同源家族蛋白較多，即便目的基因敲除或者移碼或者截短，如果抗體識(shí)別的表位是同源蛋白共有的或者移碼前的或者截短前的，那么驗(yàn)證突變體樣本依然會(huì)有條帶； ④突變體構(gòu)建不成功 由于這些原因很難驗(yàn)證，所有我們才會(huì)有不驗(yàn)證突變體的提議。如果后續(xù)客戶一定要做，認(rèn)為這是驗(yàn)證抗體特異性的標(biāo)準(zhǔn)，那么必須提供突變體樣本PCR測(cè)序結(jié)果，同時(shí)按照我們的要求發(fā)送文檔，顯示具體的突變位點(diǎn)，我們?cè)诮邮盏綐颖局螅矔?huì)先進(jìn)行檢測(cè)，在以上信息均確認(rèn)的基礎(chǔ)上，再擬定合同，啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)！ ⑤對(duì)于植物樣本： 植物蛋白之間的相互作用太復(fù)雜了，多為多倍體，而且很多在數(shù)據(jù)庫(kù)也沒(méi)信息可查詢，至于是否會(huì)出現(xiàn)基因代償?shù)茸饔茫蛘咔贸骋粋€(gè)基因，但是跟它有類似功能的高同源基因會(huì)不會(huì)替代或者促進(jìn)被突變的恢復(fù)正常表達(dá)等等，應(yīng)該目前都沒(méi)辦法解釋吧，因?yàn)槲乙膊皇亲鲞@塊的，細(xì)致的蛋白功能研究，我確實(shí)不懂，也只是跟其他研究這塊的老師有過(guò)溝通，所以目前這個(gè)HSP82目前我們只能做到這種程度了，即便再做我也沒(méi)有信心做好，因?yàn)閯偛盘岬降哪莻€(gè)高同源性基因的問(wèn)題確實(shí)存在。

要想做好磷酸化蛋白的WB檢測(cè)，樣本抽提是很關(guān)鍵的一步，但是卻又是最容易出現(xiàn)問(wèn)題的一步，因?yàn)樘幱诓煌?xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)或者特定細(xì)胞周期時(shí)，磷酸化蛋白可能僅占細(xì)胞總蛋白的一小部分，而且處理不當(dāng)時(shí)，樣品還會(huì)快速的去磷酸化；其次蛋白抽提的效率，并不是所有的蛋白都能被抽提到可溶性組分中，而且目前已有不少文獻(xiàn)證明，很多蛋白存在于被舍棄的沉淀中，所以如果蛋白抽提過(guò)程中目標(biāo)蛋白被損失了一部分，那么磷酸化和非磷酸化蛋白之間的比例就會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差；最后還有WB操作過(guò)程中的一些條件控制，比如封閉問(wèn)題，抗體使用比例問(wèn)題，或者待檢測(cè)的磷酸化蛋白量低于WB的檢測(cè)限等等，都有可能造成最終WB實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)失敗！