RNA pulldown
- RNA結合蛋白質
- 高靈敏度
- 高度特異性
- 可定量分析
服務特色
金開瑞現提供RNA pull down檢測技術服務，使用特異性二抗進行檢測，能有效避免抗體重鏈對結果的信號干擾。并且金開瑞配套自己的質譜平臺，能顯著提升檢測效果。
服務介紹
蛋白質與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA組裝、病毒復制、細胞發育調控等。使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過WB實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。若待檢測目的蛋白明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質譜鑒定。
服務優勢
- 高特異性：富集與特定RNA序列相互作用的蛋白質，具有高度的特異性
- 高靈敏度：能夠檢測低豐度的RNA結合蛋白質，提供高靈敏度的檢測能力
- 廣泛適用性：可用于研究各種RNA結合蛋白質，包括轉錄因子、RNA結合蛋白和翻譯調控因子等
- 可定量分析：通過引入外源標記或熒光標記的RNA探針，可以定量測量RNA與蛋白質的結合強度
- 聯合應用：可與其他技術相結合，如質譜分析、蛋白質組學方法和轉錄組學方法等，進一步深入研究RNA-蛋白質相互作用的功能和調控網絡
服務流程
客戶提供
RNA序列或者RNA序列構建的質粒（種屬）
相同種屬的細胞樣品
最終交付
- 基因合成測序報告；
- 構建含目的基因的質粒、菌液，測序報告；
- 體外轉錄模版的sense&antisense引物、模版電泳圖；
- RNA Pull down蛋白SDS-PAGE銀染；
- 質譜鑒定報告。
服務說明
| 服務名稱 | 服務內容 | 交付內容及標準 | 服務周期(工作日) |
| RNA pull-down （體外轉錄法） |
基因合成 |
測序報告 | 具體評估 |
| 體外轉錄sense和antisense模板擴增 | 體外轉錄2次 | 20 | |
| sense和antisense體外轉錄并標記為探針 | 探針標記2次(sense、antisense各1次) | ||
| RNA pull-down富集 | 2次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個泳道 | 4 | |
| 質譜鑒定互作蛋白 | 質譜鑒定sense、antisense | 10-15 | |
| RNA pull-down （探針法拉蛋白） |
QPCR檢測本 底表達 探針設計及合成 (包含對照) |
樣本和內參各1次 circRNA探針-biotin/lncRNA探針-biotin/普通對照探針 |
24 |
| RNA探針富集效果檢測 | 實驗探針和對照探針各1次 | ||
| RNA pull-down富集 | 實驗探針和對照探針各1次 | ||
| SDS-PAGE銀染 | 跑膠3個泳道 | 4 | |
| 質譜鑒定互作蛋白 | 質譜鑒定對照組和實驗組各1次 | 10-15 | |
| RNA pull-down (探針法拉miRNA) |
QPCR檢測本 |
樣本和內參各1次 | 28 |
| 底表達 | |||
| 探針設計及合成 | circRNA探針-biotin/lncRNA探針-biotin/對照探針 | ||
| RNA探針富集效果檢測 | 實驗探針和對照探針各1次 | ||
| RNA pull-down富集 互作的蛋白/miRNA | 實驗探針和對照探針各1次 | ||
| RNA和miRNA/lncRNA 逆轉錄及檢測 | QPCR檢測(input、探針組、對照組) |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
RNA pull down使用體外轉錄法標記生物素RNA探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質復合物。該復合物可與鏈霉親和素標記的磁珠結合，從而與孵育液中的其他成分分離。復合物洗脫后，通過western blot實驗檢測特定的RNA結合蛋白是否與RNA相互作用。 蛋白質與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA組裝、病毒復制、細胞發育調控等。若待檢測目的蛋白明確，選擇Western blot鑒定；若不明確，則可選擇質譜鑒定。
LncRNA的富集大致上有三種方法: (1)探針法：針對該LncRNA的序列，設計生物素標記的探針。此種方法最關鍵的是探針的特異性，所以最好用Northern Blot檢測探針的特異性。 可以結合內源的LncRNA是探針法的最大優勢。缺點就是比較貴，需要的樣品量大。 (2)生物素標記法：在LncRNA的5‘端加上T7啟動子，利用體外轉錄試劑盒，可以制備大量的LncRNA。再通過生物素標記試劑盒，就能得到大量的生物素標記的LncRNA。常用的折疊的方法退火，從95℃退火到4℃，大約30秒一度就可以了。 (3)TRSA法：除了生物素，鏈霉親和素還可以識別TRSA結構，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不錯的選擇。
可以，前提是circRNA在細胞中表達豐度要高。
有，探針法和生物素標記法的對照都是相應的反義序列：探針的反義序列以及長非編碼RNA的反義序列。TRSA法的對照是TRSA序列本身。
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1、RNA pull-down的實驗步驟
● 設計和合成RNA探針：根據目標RNA序列的特定區域設計和合成RNA探針，通常使用化學修飾或放射性標記來標記RNA探針。
● 準備RNA結合反應體系：將RNA探針與細胞提取物、組織提取物或體外合成的蛋白質混合，形成RNA-蛋白質復合物的反應體系。可以添加適當的緩沖液和輔助物質來維持反應條件和增加特異性。
● 進行RNA pulldown：將RNA探針與固相材料（如瓊脂糖珠子或磁珠）結合，通過親和吸附的方式富集目標RNA-蛋白質復合物。可以使用離心管、微量管或固相提取柱等不同形式的富集材料。
● 洗滌和純化：對富集的RNA-蛋白質復合物進行洗滌，以去除非特異性結合的蛋白質和其他雜質。可以使用適當的洗滌緩沖液來實現選擇性的洗滌步驟。
● 蛋白質鑒定和分析：對富集的RNA-蛋白質復合物進行蛋白質鑒定和分析，常用的方法包括質譜分析（如質譜鑒定或定量蛋白質組學），Western blotting等。這些分析方法可以幫助鑒定和定量與目標RNA相互作用的蛋白質。
2、RNA pull-down應用場景
● 鑒定RNA結合蛋白質：用于篩選和鑒定與特定RNA序列結合的蛋白質，揭示RNA的結合伴侶和調控網絡。
● 研究RNA結合蛋白質的功能：通過RNA pull-down實驗，可以評估RNA結合蛋白質的功能，包括轉錄調控、RNA穩定性和翻譯調控等。
● 研究RNA修飾修飾酶：可以用于鑒定與特定RNA修飾酶相互作用的蛋白質，了解RNA修飾的機制和調控。
● 探索RNA與疾病相關蛋白質的相互作用：通過RNA pull-down實驗，可以揭示RNA與疾病相關蛋白質的相互作用，并深入了解其在疾病發生和進展中的作用。
3、研究RNA-蛋白質相互作用的幾種常用技術簡介、優勢和適用范圍
| 技術 |
簡介 |
優勢 | 適用范圍 |
| RNA pull-down |
RNA pull-down技術用于研究RNA與與其相互作用的蛋白質之間的相互作用。該技術利用RNA的特異性結合能力，通過將RNA靶點固定在固相支持上，然后與細胞提取物或純化的蛋白質混合，通過共沉淀實驗檢測RNA-蛋白質的相互作用。 |
- 可以直接檢測RNA與蛋白質之間的相互作用。 | - 研究RNA與蛋白質之間的相互作用。 |
| - 可以篩選和鑒定與特定RNA相互作用的蛋白質。 | - 揭示RNA在基因調控和細胞功能中的作用。 | ||
| - 可以揭示RNA在基因調控和細胞功能中的作用。 | - 研究RNA參與的信號通路和疾病機制。 | ||
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- 可以與其他技術相結合，如質譜分析和轉錄組學方法，進一步研究RNA-蛋白質相互作用的功能和調控網絡。 |
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| CLIP-seq |
CLIP-seq技術（Cross-linking and immunoprecipitation followedby high-throughput sequencing）用于鑒定RNA與與其相互作用的蛋白質之間的結合位點。該技術結合了RNA與蛋白質的共價交聯和免疫共沉淀，通過高通量測序分析交聯后的RNA和結合蛋白質，鑒定它們的相互作用位點。 |
- 可以鑒定RNA與特定蛋白質之間的結合位點。 | - 鑒定RNA與蛋白質之間的結合位點和相互作用模式。 |
| - 可以全基因組范圍內分析RNA-蛋白質相互作用的模式和特征。 | - 揭示RNA參與的調控網絡和疾病機制。 | ||
| - 可以揭示RNA參與的調控網絡和疾病機制。 | - 研究RNA參與的信號傳導和細胞功能。 | ||
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- 可以提供高分辨率的RNA-蛋白質相互作用圖譜。 |
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| RNAi |
RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種通過引入特定的小分子RNA（siRNA或shRNA）來抑制特定基因表達的技術。該技術可以靶向特定的RNA序列，并降低或抑制目標基因的表達。 |
- 可以高度特異性地抑制目標基因的表達。 | - 研究基因功能和基因調控。 |
| - 可以進行基因功能研究、基因沉默和表達調控的實驗。 | - 高通量篩選和功能驗證。 | ||
| - 可以在細胞和整個生物體中進行基因敲除或敲下實驗。 | - 研究信號傳導和疾病機制。 | ||
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- 可以研究基因調控、信號通路和疾病發生機制。 |
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| RIP |
RIP（RNA Immunoprecipitation）技術用于研究RNA與與其相互作用的蛋白質之間的相互作用。該技術通過使用抗體特異性地免疫共沉淀RNA與其結合的蛋白質，從而鑒定和分析RNA-蛋白質復合物。 |
- 可以鑒定RNA與特定蛋白質之間的相互作用。 | - 研究RNA與蛋白質之間的相互作用。 |
| - 可以研究RNA參與的轉錄調控、翻譯調控和RNA穩定性等過程。 | - 揭示RNA參與的轉錄調控和翻譯調控過程。 | ||
| - 可以揭示RNA-蛋白質相互作用在細胞功能和疾病發生中的作用。 | - 研究RNA-蛋白質相互作用在細胞功能和疾病發生中的作用。 | ||
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- 可以與高通量測序等技術相結合，獲得全基因組范圍內的RNA-蛋白質相互作用圖譜。 |
