4D蛋白質組學在傳統(tǒng)3D保留時間（retentiontime）、質荷比（m/z）、離子強度（intensity）這三個維度分離基礎之上增加了第四維肽段的碰撞截面積（CCS）--離子淌度（mobility）的分離，重新定義了蛋白質組學的分析標準。4D蛋白質組學基于timsTOFPro上的PASEF技術，大幅度的提高質譜掃描速度和檢測靈敏度，實現(xiàn)蛋白質組學在鑒定深度、檢測周期、定量準確性等性能的革命性提升。

 

 

實驗流程

 

 

 

 

 

數(shù)據(jù)分析

 

 

 

 

技術優(yōu)勢

 

 

?4D技術加持，更加適合微量樣本

?克服標記定量蛋白質組學技術在樣本數(shù)量上的限制，靈活方便

?采用布魯克的timsTOFPro質譜平臺，檢測速度提升近一倍

 

針對4D蛋白質組學技術，金開瑞推出了4D Label-free、4D DIA和4D 磷酸化等4D翻譯后修飾組學技術服務，為廣大科研工作者提供高質量和全程售后的4D技術服務。

 

 

4D-DIA定量蛋白質組學

 

4D-DIA蛋白質組學是基于timsTOFPro離子淌度平臺的新一代DIA技術，通過數(shù)據(jù)非依賴采集-同步累積連續(xù)碎裂（diaPASEF）掃描模式進行差異定量蛋白質組學分析。將DIA技術與基于timsTOFPro上的diaPASEF技術相結合，具有高掃描速度和高靈敏度優(yōu)勢的同時，外加第四維離子淌度分離，使DIA數(shù)據(jù)在采集時不犧牲窗口循環(huán)速度的同時，降低譜圖復雜度和提高離子利用率，實現(xiàn)了蛋白質組學在覆蓋深度、靈敏度、通量方面的全面性提升。

 

 

技術原理

 

 

蛋白質組學技術可分為數(shù)據(jù)依賴型（Data-dependentacquisition，DDA）策略，和數(shù)據(jù)非依賴采集（Data-independentAcquisition，DIA）策略。

 

1.DDA策略：在一級質譜中在每個時間窗口采集強度較高的有限肽段離子進入二級質譜進行碎裂分析；

2.DIA策略：將質譜整個全掃描范圍分為若干個窗口，并循環(huán)地對每個窗口中的所有離子進行選擇、碎裂、檢測。

 

DIA技術可以無遺漏地獲得樣本中所有離子的全部碎片信息。因此，在定量上可以獲得更多定量信息，且基于MS2信號，定量準確度更高，重復性更好。

 

 

實驗流程

 

 

 

 

技術優(yōu)勢

 

 

1.近乎100%的離子利用率，極大提升檢測靈敏度

     在diaPASEF的掃描模式中，與離子淌度相關的CCS值和m/z之間有一定的相關性，因此四級桿可以利用這個特征逐步掃描來采集近乎100%的離子信號，極大提升檢測的靈敏度和深度；而在DDA和傳統(tǒng)的DIA模式中，這些信號只有一小部分可以被采集。

 

 

2.顯著提升檢測深度

     4D-DIA技術可顯著提升蛋白質組學檢測深度，該技術在200ngHeLa裂解液的120分鐘單針實驗中，可以鑒定超過7500種蛋白質，并且三次實驗的共同定量了6974個蛋白，數(shù)據(jù)完整性高達96%；而相比之下，在傳統(tǒng)的DIA技術中，通常需要µg級的樣品才能檢測約5000左右的蛋白。

 

3.全面提升定量完整性

     基于卓越的儀器性能和先進的采集方法，4D-DIA技術還可以進一步挑戰(zhàn)靈敏度的極限。從僅僅10ngHeLa裂解液的120分鐘單針實驗中，能夠鑒定到3323個蛋白，而相同實驗條件下的4D-DDA模式只能鑒定到2723個蛋白。而即便是在如此衡量的情況下，4D-DIA在蛋白質定量上也能實現(xiàn)了85％的數(shù)據(jù)完整性。

 

 

 

數(shù)據(jù)分析

 

 

 

 

應用方向

 

 

?臨床微量樣本最佳檢測方式，如：外泌體、FFPE石蠟切片、活檢穿刺組織等

?臨床大隊列樣本分析，如腫瘤、心血管等重大疾病精準分型

?作物群體性狀等大規(guī)模樣本研究，如育種品系、脅迫干預等

?臨床生物標志物發(fā)現(xiàn)：DIA接近MRM的定量能力，實現(xiàn)標志物篩選與初步驗證過程合二為一

?生物樣本信息庫構建：DIA可實現(xiàn)生物信息的完整保存，為后續(xù)回溯分析提供保障。藥物應答、基因敲除/過表達的蛋白表達譜分析

 

 

4D Label Free蛋白質組學

 

 

 

實驗流程

 

 

 

 

 

技術優(yōu)勢

 

 

 

4D在鑒定準度、鑒定深度、定量準確性、檢測周期上均有較大提升，樣本量要求上較大程度降低，具體性能參數(shù)如下：

 

1.鑒定更精準

4維分離，蛋白鑒定的精確度更高。尤其是生物樣本的蛋白質組成復雜，存在大量的共洗脫現(xiàn)象，在很小的保留時間內卻存在大量共洗脫肽，質量差異（m/z）小。而離子淌度中對質量差異小的肽段進行區(qū)分（離子遷移率不同），實現(xiàn)更精準的鑒定。

 

 

2.鑒定數(shù)更多

相同測試條件下，4DLabel free比傳統(tǒng)Labelfree技術檢測能力提高50%以上。例如90min，4Dlabel free蛋白組鑒定到hela蛋白5200個，鑒定數(shù)提高62.5%；11.5min，4Dlabel free蛋白組鑒定到血液蛋白超過500多個，蛋白鑒定數(shù)提高50%。

 

3.定量更穩(wěn)定

連續(xù)進樣96針，R2>0.95，CV<5%，定量范圍超過3個數(shù)量級。

 

 

4.項目周期更短

PASEF獨特的采集模式，實現(xiàn)超高掃描速度，實驗周期大幅縮減。

 

5.樣本量要求更低

4D蛋白組的上樣量降低到傳統(tǒng)方法降低1/10，只需200ng。原始樣本量降低到傳統(tǒng)方法的1/4。只需少量樣本，就能達到深度覆蓋。

 

 

數(shù)據(jù)分析

 

 

 

 

應用方向

 

 

?藥物應答、基因敲除/過表達的蛋白表達譜分析

?植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究

?疾病生物標志物與藥物作用靶點高通量分析

?蛋白作用機制與特殊功能蛋白質篩選

?各種物種的蛋白質組草圖構建

?臨床微量樣本最佳檢測方式，如：外泌體、FFPE石蠟切片、活檢穿刺組織等

 

 

修飾蛋白組學實驗思路

 

 

 

 

 

4D-修飾蛋白質組學

 

蛋白質磷酸化修飾（Phosphorylation）是生物體內最重要的共價修飾方式之一，是目前分布最多、也是最廣泛研究的修飾，其發(fā)生過程是在激酶（kinase）催化下，將ATP的磷酸根基團轉移到蛋白的氨基酸（Ser、Tyr、Thr）側鏈上。

蛋白質乙酰化（acetylation）是指在乙酰基轉移酶的催化下把乙酰基團（如乙酰輔酶A等供體）共價結合到底物蛋白質的賴氨酸殘基上的過程，主要發(fā)生在蛋白質賴氨酸殘基的ε-NH2位，其分子質量會相應增加42.01Da，質譜能夠精確地測定分子量是否發(fā)生相應的質量偏移，實現(xiàn)酰化修飾肽段及位點的分析。

蛋白泛素化修飾（Ubiquitination）發(fā)生過程是通過一個三酶級聯(lián)(E1-E2-E3)反應，使得單或多個泛素分子連接到蛋白氨基酸（Lys）側鏈上，并常伴隨蛋白酶體降解，調控蛋白表達水平變化。發(fā)生泛素化修飾的賴氨酸共價連接泛素分子，即兩個甘氨酸K-ε-GG殘基，使分子量產(chǎn)生114.1Da的質量偏移。利用質譜可精確測定分子量是否發(fā)生114.1Da的質量偏移，從而檢測泛素化修飾肽段及位點。

 

4D-labelfree修飾組基于新一代timsTOFPro質譜儀，通過數(shù)據(jù)依賴性采集-同步累積連續(xù)碎裂（ddaPASEF）掃描模式進行修飾化差異蛋白質組學分析，利用了離子淌度分離，能根據(jù)分子的形狀、截面積屬性，可有效區(qū)分修飾同分異構多肽，極大提高修飾的鑒定深度，以更少上樣量、更快掃描速度，實現(xiàn)蛋白質組學在覆蓋深度、靈敏度、通量方面的全面性提升。

 

 

實驗流程

 

 

 

 

數(shù)據(jù)分析

 

 

 

 

應用方向

 

 

 

4D-磷酸化修飾蛋白質組學

?細胞通信、生長和增殖、細胞周期調控；

?癌變的發(fā)生和轉移、神經(jīng)傳導；

?血管和胚胎形成等藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；

?植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究；

?疾病藥物作用靶點高通量分析。

 

 

4D-乙酰化修飾蛋白質組學

?代謝調控：代謝疾病、代謝紊亂等；

?藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；

?植物、微生物生長發(fā)育生理研究；

?細胞自噬、細胞周期、衰老等信號通路；

?蛋白作用機制與特殊功能蛋白質篩選；

 

 

4D-泛素化修飾蛋白質組學

?藥理藥靶、基因敲除/過表達的修飾表達分析；

?植物、微生物生長發(fā)育與脅迫逆境生理研究；

?細胞自噬、細胞周期、衰老等信號通路；

?疾病生物標志物與藥物作用靶點高通量分析；

?神經(jīng)及退行性疾病、腫瘤發(fā)病機制等機制研究；

?蛋白作用機制與特殊功能蛋白質篩選。