客戶文章分享：長鏈非編碼RNAH19作為內(nèi)源競爭性RNA通過調(diào)控RNAmiR-29b-3p來調(diào)節(jié)膀胱癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時間：2017-11-01 15:23:43

基本信息
題目：lncRNA H19 regulates epithelial–mesenchymal transition and metastasis of
bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA
期刊：Biochim Biophys Acta
影響因子：6.261
主要技術(shù)：
1、病毒轉(zhuǎn)染（慢病毒包裝、腺病毒包裝）
2、分子互作技術(shù)（Pull down、RIP（MS2/Ago）、雙熒光素酶實驗）
3、檢測分析（免疫組化、克隆形成、細(xì)胞劃痕愈合、CCK8、EdU、HE染色、WB、ELISA、q-PCR）
4、分子定位技術(shù)（FISH、IHC、免疫熒光、激光共聚焦）
5、芯片技術(shù)（lncRNA/mRNA芯片）
研究背景
EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)是多種腫瘤發(fā)展中的一個關(guān)鍵步驟，主要在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。EMT的改變主要表現(xiàn)在分子、細(xì)胞、組織水平上，它涉及了組織細(xì)胞形態(tài)的改變，同時也涉及了組織特異分子表達(dá)的改變。通過檢測相關(guān)分子表達(dá)水平或者通過檢測相關(guān)細(xì)胞形態(tài)的改變可以評估腫瘤的進(jìn)展、了解藥物的療效、基因的功能作用。lncRNA（long noncoding RNAs）與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，越來越多的研究表明，lncRNA可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡、分化進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
本文以膀胱癌和腫瘤侵襲為研究對象，聚焦EMT過程和lncRNA的功能機(jī)制，以lncRNA調(diào)控EMT的機(jī)制為主線，綜合運用芯片、生物信息學(xué)分析、分子互作技術(shù)（RIP、RNA pulldown、雙熒光素酶）、分子定位（免疫熒光、FISH）等技術(shù)研究了lncRNA的下游互作分子，探討了H19（lncRNA）的功能機(jī)制。構(gòu)建了H19調(diào)控膀胱癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用軸線（如下圖）。

研究內(nèi)容及結(jié)果
1、臨床研究水平，研究了正常人和病人H19和DNMT3B的表達(dá)水平和相關(guān)性。
2、體外實驗，尋找并綜合運用多種技術(shù)手段驗證了H19的相互作用靶分子miR-29b-3p及miR-29b-3p的相互作用靶分子DNMT3B
3、體內(nèi)實驗，運用裸鼠成瘤實驗驗證了H19對腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
一、臨床研究水平
研究了癌組織和癌旁組織以及膀胱癌細(xì)胞系中H19和DNMT3B的表達(dá)水平和相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)H19和DNMT3B在癌組織中高表達(dá)而在癌旁組織中低表達(dá)。運用pearson correlation分析發(fā)現(xiàn)H19和DNMT3B的高表達(dá)具有正相關(guān)性。這暗示了H19對DNMT3B可能具有正調(diào)控關(guān)系。這是后面作者進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測和機(jī)制功能研究的基礎(chǔ)。
1、作者首先統(tǒng)計了臨床上H19的表達(dá)和膀胱癌患者性別、年齡、腫瘤病理分期、淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的H19和膀胱癌的分期和淋巴轉(zhuǎn)移存在密切關(guān)系（P<0.05）。

2、運用芯片和q-PCR研究了H19和DNMT3B在膀胱癌和癌旁組織中的表達(dá)水平。芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)H19和DNMT3B在腫瘤組織中均高表達(dá)，而在癌旁組織中低表達(dá)，芯片的結(jié)果得到了q-PCR的驗證。

3、Pearson correlation分析發(fā)現(xiàn)H19和DNMT3B的高表達(dá)具有正相關(guān)性，說明H19對DNMT3B的表達(dá)可能具有正調(diào)控作用，如果H19作為ceRNA，則可能存在miRNA來受lncRNA的調(diào)節(jié)來調(diào)控DNMT3B。

4、在組織水平之外，作者也研究了常用的幾種膀胱癌細(xì)胞系中的H19表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)在常用的幾種癌細(xì)胞系中H19均高表達(dá)。

二、體外實驗
臨床實驗證實了H19與膀胱癌的分期、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系，同時H19和DNMT3B可能存在正調(diào)控關(guān)系。作者綜合運用多種功能實驗研究了H19的體外功能，在此基礎(chǔ)上然后運用生物信息學(xué)分析方法和多種互作技術(shù)預(yù)測并且驗證了H19的互作分子miR-29b-3p和下游調(diào)控靶分子DNMT3B。
1、功能研究。作者綜合運用CCK8、EdU、克隆形成、劃痕愈合、Transwell、免疫熒光等技術(shù)對H19的生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)H19可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞骨架重構(gòu)。

2、機(jī)制研究。生物學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)H19和DNMT3B都可以與miR-29b-3p結(jié)合。雙熒光素酶證實H19、DNMT3B可以與miR-29b-3p直接結(jié)合。FISH實驗可以發(fā)現(xiàn)H19和miR-29b-3p在細(xì)胞內(nèi)存在共定位。GFP-MS2-RIP和RNA-pulldown實驗驗證了H19可以內(nèi)源性結(jié)合miR-29b-3p。Anti-AGO2 RIP進(jìn)一步驗證了H19可以通過AGO2與miR-29b-3p結(jié)合。而H19、DNMT3B和miR-29b-3p的三因子雙熒光素酶實驗最終確認(rèn)三者的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

三、體內(nèi)實驗
在幾個膀胱癌細(xì)胞系的體外機(jī)制研究表明，H19與miR-29b、miR-29b與DNMT3B之間存在調(diào)控關(guān)系，H19作為ceRNA可以通過直接調(diào)控miR-29b來調(diào)控DNMT3B的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控下游相關(guān)分子的表達(dá)和EMT相關(guān)功能的實現(xiàn)。接著作者用裸鼠成瘤實驗驗證了H19、miR-29b對膀胱癌細(xì)胞成瘤能力、轉(zhuǎn)移能力、血管形成的影響。

文章小結(jié)
作者從臨床案例入手，發(fā)現(xiàn)了膀胱癌與H19表達(dá)的關(guān)系，然后運用芯片技術(shù)和q-PCR進(jìn)一步驗證了膀胱癌中H19和DNMT3B存在正相關(guān)關(guān)系，生物信息學(xué)分析預(yù)測了由miR-29b調(diào)控DNMT3B表達(dá)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。體外實驗中，互作分子技術(shù)（雙熒光素酶實驗、RIP、RNA pulldown）驗證了生物信息學(xué)的預(yù)測，功能實驗驗證了H19、miR-29b和DNMT3B三種在細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、EMT轉(zhuǎn)化中的作用和相互作用關(guān)系。接著作者進(jìn)一步開展了體內(nèi)實驗，裸鼠成瘤實驗證實了H19可以促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、淋巴轉(zhuǎn)移、血管生成。這樣作者從臨床、體外、體內(nèi)三個水平探究了作為ceRNA的lncRNA（H19）在調(diào)控膀胱癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移EMT轉(zhuǎn)化中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，描繪了H19/miR-29b/DNMT3B調(diào)控主線。

解析文獻(xiàn)
Lv M, Zhong Z, Huang M, Tian Q, Jiang R, Chen J. lncRNA H19 regulates epithelial-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer by miR-29b-3p as competing endogenous RNA. Biochim Biophys Acta. 2017 Oct;1864(10):1887-1899

參考文獻(xiàn)
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