客戶文章分享：通過綜合分析玉米的蛋白質豐度，轉錄水平和組織多樣性揭示其發育調控的規律
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2018-01-11 15:23:56
基本信息
題目：An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize
期刊：Journal of Proteome Research
影響因子：4.268
合作技術：SWATH
期刊：Journal of Proteome Research
影響因子：4.268
合作技術：SWATH
研究背景
植物組織和器官由分生組織特殊結構中的干細胞分化而來，包括根頂端分生組織(RAM)、芽頂端分生組織(SAM)和維管系統。不同特定器官的發育是從時間和空間上由同一基因組編碼的不同細胞類型的特定基因的選擇性表達所調控。全面系統的轉錄組分析為研究玉米不同生命周期中器官和組織特異性基因組表達模式研究提供了豐富的數據。定義基因在各個器官或組織中的表達水平對于了解玉米的發育至關重要。
然而，不同的組織或器官，包括主根，根毛，葉，核和木質部汁液中的mRNA表達水平與相應蛋白質的豐度無法一一映射，這是由mRNA轉錄和轉錄后調節，包括mRNA的加工和翻轉以及蛋白質的翻譯和翻轉所導致的。由于蛋白質是生物過程、細胞成分和性狀的直接參與者或調控者，聯合轉錄組和蛋白質組可以協同增強我們對組織結構或器官發生的理解。本研究中，作者采用了SWATH-MS技術對四種玉米組織中的蛋白質進行定量分析：包括未成熟雌穗（在V7階段），未成熟雄穗（在V8階段），授粉后20天（20_DAP）的幼胚和14日齡幼苗的根。并且對蛋白質組和轉錄組進行了關聯分析。作者嘗試鑒定組織特異性高表達的基因和蛋白質，以了解組織結構和器官發生的調節機制。這些數據為研究玉米發育生物學提供了新的線索。
然而，不同的組織或器官，包括主根，根毛，葉，核和木質部汁液中的mRNA表達水平與相應蛋白質的豐度無法一一映射，這是由mRNA轉錄和轉錄后調節，包括mRNA的加工和翻轉以及蛋白質的翻譯和翻轉所導致的。由于蛋白質是生物過程、細胞成分和性狀的直接參與者或調控者，聯合轉錄組和蛋白質組可以協同增強我們對組織結構或器官發生的理解。本研究中，作者采用了SWATH-MS技術對四種玉米組織中的蛋白質進行定量分析：包括未成熟雌穗（在V7階段），未成熟雄穗（在V8階段），授粉后20天（20_DAP）的幼胚和14日齡幼苗的根。并且對蛋白質組和轉錄組進行了關聯分析。作者嘗試鑒定組織特異性高表達的基因和蛋白質，以了解組織結構和器官發生的調節機制。這些數據為研究玉米發育生物學提供了新的線索。
研究內容及結果
1. 數據分析和蛋白質的特性
合并來自四個組織樣本的蛋白質組學數據，作者通過SWATH實驗共獲得646,658個圖譜。用不同的置信度閾值和錯誤發現率（FDR）來評估SWATH-MS的檢測能力。作者發現，在一定程度上，相對較低的閾值可以鑒定到更多獨特的肽和蛋白質（圖1A，1B）。在置信度0.85和FDR 0.05的標準下，檢測到的多肽和蛋白質的數量與使用更嚴格的閾值標準——置信度0.90和FDR 0.02相比檢測到的多肽和蛋白數量稍有增加（圖1A，1B），但差異蛋白質的數量變化不大（圖1D）。因此，最終選擇置信度0.85和FDR 0.05的閾值來檢測本研究中的肽和蛋白質，因為該閾值能檢測到更多的蛋白質來擴增蛋白質組數據，但不會顯著增加差異蛋白質的數量。共有117,184個unique譜圖匹配到10,606個unique肽段，最后共鑒定到4,551個蛋白質（圖1E）。蛋白質豐度在重復實驗中重復性很好，相關系數在0.84-0.90之間（圖S1）。在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分別鑒定到3916、3707、3702和2871種蛋白質，在這四種組織中共鑒定到2269種蛋白質（圖1E）。大多數蛋白質（70％）被不少于2個unique譜圖覆蓋，主要由10至25個氨基酸組成（圖S2A，S2B）。大約64％的蛋白質顯示出> 5％的蛋白序列覆蓋率度，84％的蛋白質的分子質量> 20kDa。
合并來自四個組織樣本的蛋白質組學數據，作者通過SWATH實驗共獲得646,658個圖譜。用不同的置信度閾值和錯誤發現率（FDR）來評估SWATH-MS的檢測能力。作者發現，在一定程度上，相對較低的閾值可以鑒定到更多獨特的肽和蛋白質（圖1A，1B）。在置信度0.85和FDR 0.05的標準下，檢測到的多肽和蛋白質的數量與使用更嚴格的閾值標準——置信度0.90和FDR 0.02相比檢測到的多肽和蛋白數量稍有增加（圖1A，1B），但差異蛋白質的數量變化不大（圖1D）。因此，最終選擇置信度0.85和FDR 0.05的閾值來檢測本研究中的肽和蛋白質，因為該閾值能檢測到更多的蛋白質來擴增蛋白質組數據，但不會顯著增加差異蛋白質的數量。共有117,184個unique譜圖匹配到10,606個unique肽段，最后共鑒定到4,551個蛋白質（圖1E）。蛋白質豐度在重復實驗中重復性很好，相關系數在0.84-0.90之間（圖S1）。在雌穗，雄穗，幼胚和幼根中分別鑒定到3916、3707、3702和2871種蛋白質，在這四種組織中共鑒定到2269種蛋白質（圖1E）。大多數蛋白質（70％）被不少于2個unique譜圖覆蓋，主要由10至25個氨基酸組成（圖S2A，S2B）。大約64％的蛋白質顯示出> 5％的蛋白序列覆蓋率度，84％的蛋白質的分子質量> 20kDa。
2. 蛋白質組與轉錄組的關聯分析
基于Doreen Ware實驗室的轉錄組數據，以及從qTeller中下載的RNA-seq數據，作者對蛋白質組和轉錄組數據進行了關聯分析。首先，將每個組織中的蛋白質豐度與相應的mRNA水平進行比較。然后過濾掉那些低mRNA水平（RPKM<1）的蛋白質，總共保留了4,314種（94.8％）蛋白，其中雌穗3554個，雄穗3404個，幼胚3417個和幼根2370個（圖2A）。其中，四個組織中共鑒定到2045個蛋白，這表明大量檢測到的蛋白存在于各個組織中。此外，還鑒定到了組織特異性高度表達的蛋白，其中幼胚253個，幼根181個，雌穗123個和雄穗43個（圖2A）。其次，盡管蛋白質豐度與組織中的mRNA水平呈正相關，但Pearson相關系數很低，從0.35（幼根）到0.43（幼胚）（圖2B），這表明轉錄水平并不總是與蛋白質豐度一一對應。
去掉組織特異性高度表達的蛋白質，以變化倍數> 2倍和P值<0.01，FDR <0.05為篩選條件，共有3714個差異蛋白至少在兩個組織中共同鑒定到。結果表明，在雌穗和雄穗之間鑒定到227個差異蛋白，在雌穗和幼根之間鑒定到799個差異蛋白（圖2D-E）。差異蛋白質的數量反映了各組織形態和功能的差異。
為了探究蛋白質與轉錄本豐度相關性較低的原因，作者將這些差異蛋白質分成如下三個亞組：i）正相關亞組（PC）：mRNA水平與蛋白質豐度正相關；ii）低相關性亞組（LC）：編碼差異蛋白的轉錄本與蛋白質豐度相關但不顯著；iii）負相關亞組（NC）：mRNA水平與蛋白質豐度呈負相關。作者發現大約50％的差異蛋白質可以歸類到PC亞組中（圖2E），這表明過半的差異蛋白質的差異豐度主要由這些基因的表達差異所決定。然而，大約42％的差異蛋白，從31％到62％不等，歸類到到LC亞組（圖2E）。這種現象通常是由于RNA轉錄，加工和轉換以及蛋白質翻譯和轉換的所導致的。4.9％至15％蛋白質歸類到NC亞組（圖2E），這表明轉錄組不能完全解釋在組織或器官的不同功能和形態的分子基礎上的蛋白質組，由此突出了蛋白質組學研究的重要性。
去掉組織特異性高度表達的蛋白質，以變化倍數> 2倍和P值<0.01，FDR <0.05為篩選條件，共有3714個差異蛋白至少在兩個組織中共同鑒定到。結果表明，在雌穗和雄穗之間鑒定到227個差異蛋白，在雌穗和幼根之間鑒定到799個差異蛋白（圖2D-E）。差異蛋白質的數量反映了各組織形態和功能的差異。
為了探究蛋白質與轉錄本豐度相關性較低的原因，作者將這些差異蛋白質分成如下三個亞組：i）正相關亞組（PC）：mRNA水平與蛋白質豐度正相關；ii）低相關性亞組（LC）：編碼差異蛋白的轉錄本與蛋白質豐度相關但不顯著；iii）負相關亞組（NC）：mRNA水平與蛋白質豐度呈負相關。作者發現大約50％的差異蛋白質可以歸類到PC亞組中（圖2E），這表明過半的差異蛋白質的差異豐度主要由這些基因的表達差異所決定。然而，大約42％的差異蛋白，從31％到62％不等，歸類到到LC亞組（圖2E）。這種現象通常是由于RNA轉錄，加工和轉換以及蛋白質翻譯和轉換的所導致的。4.9％至15％蛋白質歸類到NC亞組（圖2E），這表明轉錄組不能完全解釋在組織或器官的不同功能和形態的分子基礎上的蛋白質組，由此突出了蛋白質組學研究的重要性。
3. 組織特異性高表達蛋白的功能分類
基于蛋白質豐度，作者在四種組織中共鑒定了600種組織特異性高表達的蛋白質（圖3A）。在細胞的整個蛋白質組中，蛋白質的低覆蓋率是眾所周知的，在所有現有的蛋白質組技術，包括SWATH-MS都有明顯的缺陷。這種低覆蓋率可能導致對組織特異性高表達蛋白的數量的過高估計。因此，作者檢索了來自于qTeller的全長轉錄組數據和RNA-seq數據中編碼600個組織特異性高表達蛋白的基因的表達水平，發現大部分基因（84.3％）在多種組織中都有表達，只有94種蛋白編碼基因(15.7%)顯示出組織特異性表達模式(圖3A)。
另外，共有26種蛋白質在雌穗和雄穗中共表達，稱為花序特異性蛋白質。此外，作者利用qRT-PCR交叉驗證了18個基因的表達水平。其中15個基因為組織特異性表達基因，3個基因為呈現出花序特異性表達模式（圖3B，3D）。此外，作者還利用Western blot驗證了2個幼胚特異性蛋白（GRMZM2G354013和GRMZM2G054916）（圖3C，3E）。
作者鑒定了94個組織特異性蛋白，其中幼根60個，幼胚27個，雌穗5個和雄穗2個。幼根特異性蛋白質直接或間接地與氧化還原過程和脫氫有關，包括12個過氧化物酶超家族蛋白，3個還原酶和8個水解酶活性蛋白，表明對氧化脅迫的響應在幼根的發育和生長中起重要作用。在27個幼胚特異性蛋白中，有5種植物脂質轉移蛋白/種子儲存相關蛋白質，3種氧化還原酶活性蛋白質和2種已知的與光形態相關的蛋白質轉錄因子（AtPIF1和AtSPT轉錄因子）。7個花序特異性蛋白與花序結構和花器官的發育高度相關。值得注意的是，有18種蛋白質在雌穗和雄穗中都有很高的豐度，但其mRNA水平在四個組織中都呈現出的低水平或沒有被檢測到。
另外，共有26種蛋白質在雌穗和雄穗中共表達，稱為花序特異性蛋白質。此外，作者利用qRT-PCR交叉驗證了18個基因的表達水平。其中15個基因為組織特異性表達基因，3個基因為呈現出花序特異性表達模式（圖3B，3D）。此外，作者還利用Western blot驗證了2個幼胚特異性蛋白（GRMZM2G354013和GRMZM2G054916）（圖3C，3E）。
作者鑒定了94個組織特異性蛋白，其中幼根60個，幼胚27個，雌穗5個和雄穗2個。幼根特異性蛋白質直接或間接地與氧化還原過程和脫氫有關，包括12個過氧化物酶超家族蛋白，3個還原酶和8個水解酶活性蛋白，表明對氧化脅迫的響應在幼根的發育和生長中起重要作用。在27個幼胚特異性蛋白中，有5種植物脂質轉移蛋白/種子儲存相關蛋白質，3種氧化還原酶活性蛋白質和2種已知的與光形態相關的蛋白質轉錄因子（AtPIF1和AtSPT轉錄因子）。7個花序特異性蛋白與花序結構和花器官的發育高度相關。值得注意的是，有18種蛋白質在雌穗和雄穗中都有很高的豐度，但其mRNA水平在四個組織中都呈現出的低水平或沒有被檢測到。
4. 差異表達蛋白的功能分類
通過GO富集確定差異蛋白的功能類別。相對于其他組織對，在雌穗和雄穗之間鑒定到的差異蛋白更少，這些差異蛋白主要富集到“細胞分裂素介導的信號調節”，“乙酰輔酶A代謝過程”和“分生組織生長”（圖4A），表明細胞分裂素介導的信號在雌穗和雄穗之間的細胞分裂活性上存在差異。雄穗中UB3的蛋白質豐度比雌穗中高1.7倍，表明UB蛋白質積累的增加可能支持雄穗長枝的長出。雌穗和幼胚之間的差異蛋白主要富集到“脂質生物合成過程”，“分生組織起始”和“生殖結構發育”條目。在雄穗和幼胚之間的的差異蛋白也富集到這些GO條目（圖4B，4C）。差異蛋白中不同的GO類別反映了花序和幼胚之間的生理和發育上的差異。
此外，雌穗/雄穗和幼根之間的差異蛋白顯著富集到“對無機物質的響應”和“有機酸生物合成過程”（圖4D，4F）。幼胚和幼根之間的差異蛋白主要富集到“有機酸代謝過程”，“對無機物質的反應”和“氧化還原”（p = 2.6 E-12）等。與“脂質生物合成過程”和“脂肪酸生物合成過程”有關的蛋白質在幼胚中顯著富集，而涉及“響應無機物質”，“氧化還原”和“醇代謝過程”的蛋白質在幼根中顯著富集。
此外，雌穗/雄穗和幼根之間的差異蛋白顯著富集到“對無機物質的響應”和“有機酸生物合成過程”（圖4D，4F）。幼胚和幼根之間的差異蛋白主要富集到“有機酸代謝過程”，“對無機物質的反應”和“氧化還原”（p = 2.6 E-12）等。與“脂質生物合成過程”和“脂肪酸生物合成過程”有關的蛋白質在幼胚中顯著富集，而涉及“響應無機物質”，“氧化還原”和“醇代謝過程”的蛋白質在幼根中顯著富集。
文章小結
SWATH-MS具有獨立的數據采集模式，能夠掃描樣品中所有電離物質的碎片離子譜，具有高重復性，高定量準確性以及定量動態范圍更廣等優點。作者利用SWATH-MS技術在玉米的4種組織中共鑒定到4551種蛋白質，與之前利用iTRAQ技術鑒定到的蛋白數目相當。基于蛋白質組和轉錄組數據的關聯分析，作者推斷出蛋白質豐度與mRNA水平呈正相關，具有弱到中等的相關系數。
然而，一些特定組織中與功能或結構相關的一些關鍵蛋白質在轉錄水平上被時空調控，在4種研究組織中不同的蛋白表現出不同的表達模式。此外，組織特異性高表達的蛋白和差異蛋白能富集到不同的GO類別中。組織特異性高度表達的蛋白質亞組通過交叉實驗驗證可作為潛在的生物標志物。這些蛋白質組學數據加深了對玉米組織和器官發育的分子機制的理解，并為其生物標志物的發現提供了全面的線索。
然而，一些特定組織中與功能或結構相關的一些關鍵蛋白質在轉錄水平上被時空調控，在4種研究組織中不同的蛋白表現出不同的表達模式。此外，組織特異性高表達的蛋白和差異蛋白能富集到不同的GO類別中。組織特異性高度表達的蛋白質亞組通過交叉實驗驗證可作為潛在的生物標志物。這些蛋白質組學數據加深了對玉米組織和器官發育的分子機制的理解，并為其生物標志物的發現提供了全面的線索。
解析文獻
Jia HT, Sun W, Li MF, et al. An integrated analysis of protein abundance, transcript level and tissue diversity to reveal developmental regulation of maize [J]. J. Proteome Res, December 18, 2017.
參考文獻
1. Du, Y.; Liu, L.;et al. UNBRANCHED3 regulates branching by modulating cytokinin biosynthesis and signaling in maize and rice. New Phytol. 2017, 214(2), 721-733.
2. Anjo, S. I.; Santa, C.; Manadas, B. SWATH-MS as a tool for biomarker discovery from basic research to clinical applications. Proteomics 2017, 17(3-4), 1600278
3. Cheng, Z.; Teo, G.; et al. Differential dynamics of the mammalian mRNA and protein expression response to misfolding stress. Mol. Syst. Biol. 2016, 12(1), 855.
4. Walley, J. W.; Sartor, R. C.; et al. Integration of omic networks in a developmental atlas of maize. Science 2016, 353:814-818.
5. Pautler, M.; Eveland, A. L.; et al. FASCIATED EAR4 encodes a bZIP transcription factor that regulates shoot meristem size in maize. Plant Cell 2015, 27(1), 104-120.
參考文獻
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4. Walley, J. W.; Sartor, R. C.; et al. Integration of omic networks in a developmental atlas of maize. Science 2016, 353:814-818.
5. Pautler, M.; Eveland, A. L.; et al. FASCIATED EAR4 encodes a bZIP transcription factor that regulates shoot meristem size in maize. Plant Cell 2015, 27(1), 104-120.
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