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技術支持
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Q:測定了制品的OD值后發現OD260/OD280<1.8,制品質量 (純度) 合格嗎?

由于核酸在260 nm附近有強吸收,而蛋白質在280 nm附近有強吸收,從生物體內提取核酸時,常用OD260/OD280比值來評價核酸純度 (比值在1.8~2.0之間),這一判斷是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同時的結果。而合成的DNA/RNA則不同,序列很短 (通常在20~30個堿基之間),其中A、G、C、T各種堿基所占比例很不相同,由于各種堿基的摩爾消光系數不同,因此不同堿基構成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同,例如當序列中C、T堿基的含量高時,該比值會大大低于1.8。此外,序列中堿基的排列順序也影響該比值。所以不能根據OD260/OD280比值來評價合成DNA/RNA制品的純度。

Q:使用3%的Agarose凝膠電泳合成Oligo DNA制品,發現有很多條泳帶,為什么?

Oligo DNA的電泳一定要使用變性PAGE電泳。Oligo DNA是單鏈DNA,容易形成復雜的立體結構,因此進行Agarose電泳時,容易出現多條泳帶 (更無法用Agarose電泳進行定量了)。

Q:進行PAGE電泳時,長度完全一樣的Oligo DNA為什么泳帶不在同一位置?

A、G、C、T的組份不同,電泳速度不同; DNA的立體結構不同,電泳速度不同。 這種情況在Oligo DNA越短時越容易發生,長鏈Oligo DNA之間差別越小。

Q:一般的合成Oligo DNA的5' 和3' 末端有磷酸基團嗎?

沒有,5' 和3' 末端均為-OH基。如需要加磷酸基團,訂貨時請特別注明,此時需收取磷酸化 (PO4修飾) 的費用。

Q:能否根據電泳帶的亮度對合成的DNA/RNA制品進行定量?

不能。 因為EtBr是通過嵌入到核酸的雙螺旋間而使其著色的。合成的DNA/RNA分子為單鏈,只有通過自身回折形成局部發夾環結構或鏈間形成部分雙螺旋結構,才能被EtBr染色。由于不同制品的序列不同,形成雙螺旋的能力不同,因此染色能力不盡相同,也就不能根據EtBr染色帶的亮度來對合成的DNA/RNA進行定量。

Q:引物片段退火后不能連接到載體上是什么原因?

連接反應的引物如果沒有5’磷酸基團,連接效率相對較低,但不是完全不能成功。 如果磷酸化的產物還不能連接載體上,需要檢查載體的酶切效果以及核對引物的設計方案,如果都沒有問題就要考慮改善引物退火的條件以及連接反應體系。

Q:貴公司可合成多長的DNA,多長的RNA?

合成DNA的長度為6~130個堿基;合成RNA的長度為8~35個堿基。當合成的DNA序列較長時,由于合成及純化方法的限制,很難保證制品中每個序列都正確無誤。此外需要說明的是:如果待合成序列比較特殊 (例如多個“G”連續出現等),合成收率相對較低,我們可能會根據具體情況加收費用;有時我們也可能無法合成訂購的序列,此時本公司保留不接受定單的權利。

Q:合成的DNA應如何保存?

干燥制品很穩定,-20℃下保存2年沒問題。 溶解后的DNA也請保存于-20℃,最好是分份保存,避免反復凍融。 溶液中的Oligo DNA在常溫下放置3~4天應該沒問題,但最好不要放置一個星期以上。其壽命與容器、溶劑的滅菌程度有關。

Q:已經溶解的引物,為什么原先使用正常,而過一段時間再使用就不好了?

如果您溶解引物的水PH過低或污染了菌或核酸酶,會使引物降解。使用時沒有充分解凍混合,液體不均勻也可能會造成引物加入量不準確。建議分裝引物,避免反復凍溶。建議使用10mM Tris pH7.5緩沖液溶解引物,因為有些蒸餾水的pH值比較低(pH4-5), 引物在這種條件下不穩定。還有一種可能性是引物沒有問題,而是PCR使用材料特別是模板的質量與先前使用的不完全一致。

Q:引物質量好壞的判斷標準是什么?

合成的引物和您的定單序列一致,而不是能否擴增出您所需要的產物。

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