專業(yè)互作研究技術(shù)團(tuán)隊
豐富互作類設(shè)計經(jīng)驗
1000+互作實施項目經(jīng)驗
流程設(shè)計到技術(shù)實施一站式服務(wù)
miRNA可以與mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)體內(nèi)基因的表達(dá)，通過影響蛋?的表達(dá)、修飾、酶活性等來調(diào)節(jié)?命活動的進(jìn)?。lncRNA作為體內(nèi)的ceRNA，可以與miRNA結(jié)合起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作?。研究lncRNA與miRNA的相互作?對于研究?命具有重要的意義。
雙熒光素酶檢測是轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中?分重要的實驗?段，主要應(yīng)?于啟動?和轉(zhuǎn)錄因?，以及miRNA和其靶基因互作的驗證。
- 在雙熒光素酶檢測中，將螢??熒光素酶作為實驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。實驗報告基因?于測試實驗條件下基因的表達(dá)，?對照報告基因作為內(nèi)對照。
- 以熒光素為底物來檢測螢??熒光素酶活性，熒光素酶可以催化熒光素，在熒光素氧化的過程中會發(fā)出?物熒光，然后通過化學(xué)發(fā)光儀測定。
● 轉(zhuǎn)錄因?與啟動?
將啟動子序列構(gòu)建到螢火蟲熒光素酶基因前，同時過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與啟動子上特異結(jié)合位點結(jié)合后激活熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄，使螢火蟲熒光素酶得以表達(dá)，最終熒光強(qiáng)度上升；當(dāng)結(jié)合位點被突變后，轉(zhuǎn)錄因子無法與啟動子結(jié)合，因此熒光值無明顯變化。
● miRNA與靶基因
將靶基因序列構(gòu)建到螢火蟲熒光素酶基因3'區(qū)域，同時過表達(dá)microRNA。當(dāng)microRNA與靶基 因上特異結(jié)合位點結(jié)合后，將干擾熒光素酶mRNA的翻譯或?qū)е缕溲杆俳到猓篃晒鈴?qiáng)度降低；當(dāng)結(jié)合位點被突變后，microRNA無法與靶基因結(jié)合，因此熒光值無明顯變化。
YY1-mediated reticulocalbin-2 upregulation promotes the hepatocellular carcinoma progression via activating MYC signaling.
期刊：Am J Cancer Res IF：5.177
Schematic illustration of YY1 binding site on the wild type and mutant RCN2 promotor. Fluorescence activity in Huh7 cells with RCN2 wildtype and mutant promotor with YY1 pcDNA3.1.
蛋白與核酸的相互作用廣泛存在于生命活動的調(diào)節(jié)中。基因的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等過程都離不開核酸和蛋白的互作。金開瑞提供RNA pull down+質(zhì)譜、雙熒光素酶、染色質(zhì)免疫共沉淀、凝膠遷移或電泳遷移率檢測（EMSA）、酵母單雜交、DNA pull down等技術(shù)來檢測DNA/RNA與蛋白的相互作用。
凝膠遷移或電泳遷移率檢測（Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA）是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA 序列相互結(jié)合的技術(shù)，可用于定性和定量分析。目前已用于研究DNA 結(jié)合蛋白和特定的DNA 序列的相互作用，是轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。
金開瑞提供EMSA 檢測技術(shù)服務(wù)，幫助您檢測DNA 結(jié)合蛋白、RNA 結(jié)合蛋白、特定的蛋白質(zhì)。
目的蛋白與生物素標(biāo)記的DNA探針結(jié)合，電泳時蛋白-DNA復(fù)合物比無蛋白結(jié)合的DNA探針在凝膠中泳動的速度慢，顯影出現(xiàn)相對滯后條帶。
Functional Analysis of IRF1 Reveals its Role in the Activation of the Type I IFN Pathway in Golden Pompano, Trachinotus ovatus (Linnaeus 1758).
期刊：Int J Mol Sci. IF：4.183
Binding reactions of IRF1 and ToIFNa3 prompter. Biotin-labeled EMSA probes were incubated with lysates of HEK293T cells containing ToIRF1 protein.WT,wild-type probe;MT:mutated probe.1,negative control;2,positive control;3,plus ToIFNa3-P2-WT5;4,ToIFNa3-P2-WT5 plus ToIRF1-Flag;5,plus ToIFNa3-P2-MT5;6,ToIFNa3-P2-MT5 plusToIRF1-Flag.
ChIP染色體免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是用來研究蛋白質(zhì)與DNA是否在體內(nèi)存在相互作用，這項技術(shù)幫助研究者判斷在細(xì)胞核中基因組的某一特定位置會出現(xiàn)何種組蛋白修飾。利用抗體抗原特異性結(jié)合，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來，能夠真實地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。
YAP inhibits autophagy and promotes progression of colorectal cancer via upregulating Bcl-2 expression
期刊：Cell Death Dis IF：6.304
C ChIP-qPCR was performed in SW620 cells transfected with pcDNA3.1-HA-YAP to identify the enrichment of HA-YAP onto Bcl-2 promoter region. IgG served as an antibody control.
DNA pull down是用于分析蛋白質(zhì)與DNA互作的一種分析技術(shù)。一般來說，該實驗首先需要針對待研究目的基因的調(diào)控區(qū)域設(shè)計并制備特異性探針（以脫硫生物素標(biāo)記為主流）；同時，制備細(xì)胞核提取物；將探針和核提取物共同孵育，DNA結(jié)合蛋白就會和靶向序列特異性結(jié)合；然后，通過親和素磁珠純化蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物；最后針對獲得的蛋白，使用WB驗證或者質(zhì)譜方式鑒定蛋白質(zhì)類型。
應(yīng)用：尋找已知的啟動子序列所結(jié)合的未知蛋白（轉(zhuǎn)錄因子）
結(jié)果：實驗組和對照組之間存在差異條帶
酵母單雜交技術(shù)是在酵母雙雜基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種研究核酸-蛋白相互作用的工具，被廣泛用于研究真核細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控，如鑒別DNA結(jié)合位點發(fā)現(xiàn)潛在的結(jié)合蛋白基因、分析DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域信息等。
| 項目名稱 | 應(yīng)用 | 互補實驗 |
|---|---|---|
| 酵母雜交文庫構(gòu)建 | 酵母雜交篩選 | / |
| 酵母單/雙雜交驗證 | 已知蛋白與蛋白/啟動子之間的互作 | EMSA，雙熒光素酶，Co-IP，GST pulldown |
核酵母單/雙雜交系統(tǒng)原理：酵母轉(zhuǎn)錄因子Gal4包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Gal4-BD）和轉(zhuǎn)錄激活域（Gal4-AD），誘餌（prey）與Gal4-BD融合，獵物（bait）蛋白與Gal4-AD融合，當(dāng)誘餌和獵物發(fā)生相互作用時，Gal4-BD和Gal4-AD在空間上充分接近，可呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，啟動激活報告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的轉(zhuǎn)錄。
1: Pabai-Bait+PGADT7(自激活驗證)
2: Pabai-Bait+PGADT7-Prey(實驗組)
+: Pabai-P53+PGADT7-53(陽性對照)
- : Pabai-P53+PGADT7(陰性對照)
蛋白質(zhì)與RNA 的相互作用是許多細(xì)胞功能的核心，如蛋白質(zhì)合成、mRNA 組裝、病毒復(fù)制、細(xì)胞發(fā)育調(diào)控等。使用體外轉(zhuǎn)錄法標(biāo)記生物素RNA 探針，然后與胞漿蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。該復(fù)合物可與鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠結(jié)合，從而與孵育液中的其他成分分離。復(fù)合物洗脫后，通過WB 實驗檢測特定的RNA 結(jié)合蛋白是否與RNA 相互作用。若待檢測目的蛋白明確，選擇WB鑒定；若不明確，則可選擇質(zhì)譜鑒定。
金開瑞現(xiàn)提供RNA pull down 檢測技術(shù)服務(wù), 使用特異性二抗進(jìn)行檢測，能有效避免抗體重鏈對結(jié)果的信號干擾。并且金開瑞配套自己的質(zhì)譜平臺，能顯著提升檢測效果。
Circular RNA circEsyt2 regulates vascular smooth muscle cell remodeling via splicing regulation
期刊：J Clin Invest IF：11.864
CircEsyt2 inhibits the nuclear trafficking of PCBP1 by binding directly to PCBP1. (A) Western blotting of proteins pulled down by control and circEsyt2 probes in circEsyt2-OE HEK293T cells using the PCBP1 antibody. (B) Identification of circEsyt2-binding proteins. Left: silver staining of pulled-down proteins in circEsyt2-OE HEK293T cells. Right: mass spectrometry showing the main proteins pulled down by the circEsyt2 probe.
RIP 技術(shù)（RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay，RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀）主要是運用針對目標(biāo)蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復(fù)合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復(fù)合物上的RNA 進(jìn)行q-PCR驗證或者測序分析。RIP 是研究細(xì)胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)，是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具，可以幫助我們發(fā)現(xiàn)miRNA 的調(diào)節(jié)靶點。
根據(jù)客戶需求，金開瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作驗證RIP技術(shù)服務(wù)。
CircPVT1 promotes proliferation of lung squamous cell carcinoma by binding to miR-30d/e
期刊：J Exp Clin Cancer Res IF：11.161
c RIP confirmed the relationship between circPVT1 and HuR in H520 cells. GAPDH mRNA was used as a non-HuR target control.
利用帶有標(biāo)簽的已知蛋白作為誘餌蛋白（最常用的是GST標(biāo)簽，即谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶，glutathione S-transferase），誘餌蛋白特異性結(jié)合谷胱甘肽親和樹脂，當(dāng)目的蛋白溶液過柱時，將誘餌蛋白及其相互作用的蛋白復(fù)合物捕獲。復(fù)合物洗脫后，通過蛋白凝膠電泳分析兩種蛋白間的相互作用，或者篩選相應(yīng)的目的蛋白。
Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia
期刊：J Clin Invest IF：11.864
(C) GST pull-down assay revealing the interaction between LDLR and Shc (n = 3 in each group).
免疫共沉淀技術(shù)（co-Immunoprecipitation, co-IP）是一種研究兩種蛋白在體內(nèi)是否存在相互作用的有效方法，通過抗體和已知蛋白結(jié)合，從而捕獲整個已知蛋白復(fù)合物，進(jìn)而研究復(fù)合物中與已知蛋白存在相互作用的蛋白。
Aberrant oligodendroglial LDL receptor orchestrates demyelination in chronic cerebral ischemia
期刊：J Clin Invest IF：11.864
LDLR protects against demyelination by binding Shc and activating downstream MEK/ERK signaling. (A) Immunoassay of lysates of cerebral CC tissue after immunoprecipitation with LDLR, analyzed by immunoblotting (IB) with anti-LDLR and anti-Shc (n = 3 in each group).
酵母雙雜交及系統(tǒng)是一種鑒定和檢測蛋白質(zhì)相互作用的研究方法，因其具有靈敏性高、功能強(qiáng)大、適用范圍廣等特點，現(xiàn)已被應(yīng)用于多個研究領(lǐng)域。
金開瑞可提供酵母雜交文庫構(gòu)建、核酵母雙雜交篩選、膜酵母雙雜交篩選、酵母單/雙雜交驗證服務(wù)。
| 項目名稱 | 應(yīng)用 | 互補實驗 |
|---|---|---|
| 酵母雜交文庫構(gòu)建 | 酵母雜交篩選 | / |
| 核酵母雙雜交篩選 | 獲得與已知蛋白互作的未知蛋白 | COIP，GST pulldown |
| 膜酵母雙雜交篩選 | 研究膜蛋白之間的互作 | COIP，GST pulldown |
| 酵母單/雙雜交驗證 | 已知蛋白與蛋白/啟動子之間的互作 | EMSA，雙熒光素酶，COIP，GST pulldown |
膜酵母雙雜交系統(tǒng)原理：泛素ubiquitin包含N 端（Nub），C 端（Cub）結(jié)構(gòu)域。首先，人為的將泛素 Nub的第3位異亮氨酸突變?yōu)楦拾彼幔∟ubI 突變?yōu)?NubG）。這樣與 Cub 的親合力大大降低，避免了 Cub 和 Nub 自我結(jié)合或接近的可能性。在Cub結(jié)構(gòu)域融合LexA-VP16 轉(zhuǎn)錄激活因子形成Cub-LexA-VP16。誘餌蛋白（prey）與NubG融合，獵物蛋白（bait）與Cub-LexA-VP16融合。，當(dāng)當(dāng)誘餌和獵物發(fā)生相互作用時， NubG 和 Cub 的相互接近，結(jié)合，形成完整泛素ubiquitin，從而被 UBPs 酶識別，導(dǎo)致 LexA-VP16 的剪切，進(jìn)入核內(nèi)，從而激活報告基因AUR1-C、ADE2、HIS3和MEL1的轉(zhuǎn)錄。
① 酵母雜交文庫構(gòu)建
圖?來源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4
② 酵母雙雜交篩選
陽性結(jié)果點鐘SD/-Leu/-Trp/-HIS3/-ADE2+X-α-gal平板
圖?來源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4
陽性結(jié)果PCR鑒定
圖?來源于 Xu et al. BMC Biotechnology (2020) 20:4
③ 酵母雜交驗證（可用于文章發(fā)表）
1: PGBKT7-Bait+PGADT7(?激活驗證)
2: PGBKT7-Bait+PGADT7-Prey(實驗組)
+: PGBKT7-53+PGADT7-T(陽性對照)
- : PGBKT7-lam+PGADT7-T(陰性對照)
雙分子熒光互補（Bimolecular Fluorescent Complimentary，BiFC）技術(shù)基于蛋白質(zhì)片段互補的原理，用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用。其原理是將熒光蛋白（如綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白YFP等）切割為兩個互補但各自不發(fā)光的片段（如N端和C端片段），分別與待檢測的蛋白質(zhì)A和B融合表達(dá)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)A與蛋白質(zhì)B在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生相互作用時，熒光蛋白片段靠近并重組為完整的熒光蛋白，從而在顯微鏡下產(chǎn)生熒光信號，直觀地反映了蛋白質(zhì)間的相互作用。
分子、細(xì)胞、個體水平上的機(jī)制研究、功能研究、表型研究是生物學(xué)研究中的熱點。分子（核酸與核酸、核酸與蛋白、蛋白與蛋白）互作研究是機(jī)制研究的重要組成部分，是功能、表型研究的進(jìn)一步深化。隨著人類基因組計劃的完成，后基因組時代的深入，測序、質(zhì)譜、生物信息聯(lián)合分析等技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，使得高通量篩選生物標(biāo)記物、尋找生物關(guān)聯(lián)分子變得可能，同時對分子互作技術(shù)的應(yīng)用提出了更高的要求。
金開瑞多年來致力于分子互作機(jī)制研究，組建了專門的分子互作研究技術(shù)團(tuán)隊，擁有豐富的互作類項目設(shè)計、實施經(jīng)驗，可以為您提供核酸與核酸、核酸與蛋白、蛋白與蛋白間等各類從方案流程設(shè)計到技術(shù)實施的整套互作研究服務(wù)。
此外，金開瑞生物還特別推出了多款高效、簡便且經(jīng)濟(jì)實惠的互作分析小規(guī)格試劑盒，包括但不限于RIP kit(6T)、Co-IP kit(動物/植物)(6T)、ChIP kit(動物/植物)(6T)、RNA pull-down kit(6T)、銀染試劑盒(10T/20T/40T)、DNA pull-down kit(動物/植物)(6T)和雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(50T)，旨在為您的研究提供更多的選擇，歡迎采購。
