服務介紹
雙熒光素酶檢測是轉錄調控研究中十分重要的實驗手段，主要應用于啟動子和轉錄因子，以及miRNA和其靶基因互作的驗證。
在雙熒光素酶檢測中，將螢火蟲熒光素酶作為實驗報告基因，海腎熒光素酶作為對照報告基因。實驗報告基因用于測試實驗條件下基因的表達，而對照報告基因作為內對照。
以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性，熒光素酶可以催化熒光素，在熒光素氧化的過程中會發出生物熒光，然后通過化學發光儀測定。
服務優勢
- 靈敏度高：比Western blot靈敏度高1000倍以上
- 無報告基因： 植物、哺乳動物中無報告基因內源性表達
- 不受物質影響：熒光素酶檢測不受細胞內其它物質影響
- 檢測方便/范圍廣：檢測范圍廣，大于7個數量級
服務流程
客戶提供
基因模板，需提供詳細的轉錄因子、目的基因、或microRNA信息；
實驗細胞，如無特殊要求，金開瑞默認為使用293T細胞，則無需提供。
最終交付
- 實驗流程及完整報告一份，包括實驗原始數據、圖片、分析結果等。
服務說明
| 服務名稱 | 服務內容 | 交付內容及標準 | 服務周期（工作日） |
| 動物雙熒光 | 靶點基因合成 | 含400bp以下，>400bp見附加單項 | 20 |
| 質粒提取 | 返還目的基因剩余質粒 | ||
| mimics合成 | 注：僅驗證miRNA需合成mimics | ||
| 細胞轉染 | 默認做4組，每組5生物學重復 | ||
| 雙熒光素酶檢測 | 交付結題報告及原始數據 | ||
| 植物雙熒光（定量） | 質粒提取 | 返還目的基因剩余質粒 | 20 |
| 注射煙草 | 每片葉子上做4組，設5生物學重復 | ||
| 雙熒光素酶檢測 | 交付結題報告及原始數據 | ||
| 植物雙熒光（定性+定量） | 質粒提取 | 返還目的基因剩余質粒 | 20 |
| 注射煙草 | 每片葉子上做4組，設5生物學重復 | ||
| 拍攝照片 | 交付3片葉子照片 | ||
| 雙熒光素酶檢測 | 交付結題報告及原始數據 |
案例展示
常見問題與解析 (Q&A)
a.啟動子結構分析，將啟動子區域序列（通常2k左右）進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建入luciferase報告載體，檢測其啟動子活性。 b.啟動子SNP分析，一些基因的啟動子區域存在單核苷酸多態性，可運用熒光素酶報告系統分析其相對活性。 c.驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用，將該序列（通常為啟動子區域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞中共轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。 d.可以分析信號通路是否激活，將該信號通路的下游響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性代表了通路的下游響應。例如在GPCR研究中，將cAMP response element（CRE）載入報告基因載體，構建穩定表達細胞株后，可以用于分析GPRC的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsive element (HRE)插入luciferase報告載體構建穩轉細胞株，可以用于低氧相關通路的研究。 e.驗證microRNA的靶序列，將待測的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。
Luciferase的靈敏度相比于GFP提高10-100倍以上，同時具有更寬的動態范圍，便于數值分析比較，不需要熒光顯微鏡，而且在活體實驗中其熒光穿透性高于EGFP等熒光蛋白，同時由于沒有內源活性、其本底信號很低。 而GFP等熒光蛋白相比于熒光素酶的優勢在于可以進行失蹤定位，并且其觀測不需裂解細胞，方便進行適時觀察。
海腎熒光素酶和螢火蟲熒光素酶相比，相對活性如何？ 在氧、鎂和ATP的存在下，螢火蟲熒光素酶作用于螢火蟲熒光素，而來源于海洋腔腸（Renilla reniformis)的熒光素酶在氧的存在下作用于海腎熒光素。雙報告基因技術（Dual-reporter assays）,結合了螢火蟲熒光素酶測試和海腎熒光素酶測試。
轉染效率低的話可以從三個方面改善，首先要確保細胞狀態是好的，通常我們選出處于分裂期的細胞，另外陽性對照您可以選擇過表達的熒光蛋白質粒，還有就是DNA的質量尤為重要，最好是先酶切驗證。 這個實驗檢測結果很靈敏，有一定差異是正常的，通常只要確保它在一個數量級之內即可。如果差異超出這個范圍可以從兩方面改善，一是記住保持樣本的均一性，二是加樣要準確。
相關資源
1、在雙熒光素酶報告系統研究中，一些常用網站、數據庫和資源庫的簡介
● Promega（promega.com）：Promega是一個提供生命科學研究相關產品和服務的公司。他們提供多種熒光素酶底物和相關試劑盒，供科研人員在雙熒光素酶報告系統實驗中使用。
● Addgene（addgene.org）：Addgene是一個非營利性的生物資源庫，提供了廣泛的質粒和表達載體，包括熒光素酶相關的質粒，供研究人員用于基因轉染和表達。
● NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）：NCBI（美國國家生物技術信息中心）提供了包括PubMed、GenBank、Gene等在內的多個數據庫，可用于搜索和獲取與雙熒光素酶報告系統相關的文獻、基因序列和蛋白質信息。
● PubChem（pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）：PubChem是NCBI的一個化學物質數據庫，提供了大量的化合物信息和相關的生物活性數據，可以用于熒光素酶底物的篩選和選擇。
2、雙熒光素酶報告系統的實驗步驟簡介
①細胞培養和處理：
● 準備和處理目標細胞，確保其在適當的生長狀態下進行實驗。
● 維持適當的培養條件，包括培養基成分、溫度和濕度等。
②底物處理：
● 加入熒光素酶底物和葡萄糖氧化酶底物以觸發熒光發光反應。
● 優化底物濃度，確保使用濃度適當，以獲得穩定且可檢測的熒光信號。
③信號檢測：
● 使用合適的設備進行熒光或發光信號的檢測。
● 選擇適當的檢測方法，如熒光成像儀、熒光分析儀或酶標儀。
④數據分析：
● 進行相對熒光單位的定量分析，并設置負對照和正對照組。
● 使用合適的數據分析方法，評估實驗結果的特異性和可靠性。
⑤實驗重復和統計顯著性：
● 進行足夠的實驗重復以確保結果的可靠性。
● 根據需要進行統計學分析，以評估數據的顯著性和可靠性。
⑥實驗條件控制：
● 保持實驗條件的一致性，包括細胞培養條件、培養基配制、底物制備等。
● 嚴格控制實驗的時間點和溫度，確保實驗操作在合適的時間窗口內進行。
⑦數據報告和結果解釋：
● 撰寫實驗報告或論文，清晰地呈現數據和結果。
● 結合相關背景知識和文獻，解釋實驗結果的意義和可能的機制。
3、除了雙熒光素酶報告系統實驗，還有哪些常用于研究基因表達調控和信號通路活性的實驗方法？
① 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）：
? 使用特異性抗體將目標蛋白與其相互作用的分子（如蛋白質復合物或DNA序列）結合，并通過沉淀、洗滌和分析來鑒定和定量這些相互作用。
② 染色質免疫沉淀（ChIP，ChIP-seq）：
? 利用特異性抗體將某個蛋白質與染色質中的靶標位點結合，并通過免疫沉淀和測序技術，鑒定和分析該蛋白質在基因組上的結合位點及其調控作用。
③ 蛋白質互作分析：
? 利用蛋白質交聯、共沉淀和質譜分析等技術，鑒定和分析蛋白質之間的相互作用關系，從而揭示基因表達調控和信號通路中的蛋白質網絡。
④ 基因組學和轉錄組學分析：
? 利用高通量測序技術，如RNA-seq、ChIP-seq和ATAC-seq等，全面分析基因表達、染色質狀態和轉錄因子結合位點，揭示基因調控網絡和信號通路的動態變化。
