重組蛋白在大腸桿菌中大量表達時，很容易在胞內(nèi)形成不可溶的包涵體，為后期的純化復性帶來麻煩。而且，復性所得到的蛋白活性很低甚至沒有活性。因此，提高重組蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達是十分必要的。 可以從以下幾點進行優(yōu)化： 1) 選擇合適的宿主細胞； 2) 采用合適的融合標簽表達； 3) 選擇合適的質粒載體； 4) 優(yōu)化培養(yǎng)誘導條件。

重組蛋白在大腸桿菌中表達很難準確折疊的主要原因是大腸桿菌的細胞質環(huán)境呈現(xiàn)還原性，不利于二硫鍵的形成。針對這一原因，研究人員對細胞內(nèi)表達，主要還原途徑的兩個關鍵酶的基因進行突變。構建了有利于二硫鍵形成，蛋白準確折疊的感受態(tài)細胞。如origami（DE3）,origamiB（DE3）,Rosetta-gami（DE3）,shuffle等。

融合標簽用于檢測和純化目的蛋白。有時也通過增加目的蛋白在細胞質中的可溶性或幫助將目的蛋白轉運到細胞周質中以提高目的蛋白的生物活性。在原核表達載體或蛋白序列中常添加一些可溶性標簽，如GST、MBP、SUMO等。這些標簽在宿主中表達的蛋白質會有高度的可溶性。在與外源蛋白質融合后，從而促進外源蛋白的可溶性表達。

影響原核表達的因素包括有：翻譯起始位點、GC含量、mRNA二級結構、密碼子的偏愛性、質粒載體的選擇、基因或者蛋白的大小、外源基因對宿主有毒性、基因突變（移碼突變）、培養(yǎng)誘導條件等。

1) 翻譯后的修飾（post-translational modification）如磷酸化，糖基化均能增大分子量； 2) 翻譯后蛋白的自我切割（post-translation cleavage）自身斷裂會降低分子量； 3) 有的蛋白有好幾種異構體（splice variants），每個異構體的分子量都不一樣，注意區(qū)分； 4) 自身所帶電荷量有關（the composition of amino acids (charged vs non-charged)）； 5) 多聚體（multimers -）會增大分子量。

您可以選擇液態(tài)形式或者凍干粉形式發(fā)貨，蛋白凍干需要收取一定的費用。凍干粉采用去離子無菌水復溶，完全溶解即可，具體濃度根據(jù)您的實驗需求而定。

載體（vector），指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉移至受體細胞的一種能自我復制的DNA分子。三種最常用的載體是細菌質粒、噬菌體和動植物病毒。載體的種類與宿主相匹配，根據(jù)宿主不同，分為原核（細菌）表達載體、酵母表達載體、植物表達載體、哺乳動物表達載體、昆蟲表達載體等。載體中含有外源基因片段。通過載體介導，外源基因可以在宿主中表達。金開瑞主要是原核表達載體。

（1）目的基因獲取 （2）質粒構建 （3）菌株篩選 （4）表達條件優(yōu)化 （5）蛋白純化

A 測序結果，包括序列和測序峰圖片； B 質粒載體名稱；C重組克隆質粒10ul或者表達質粒20ul濃度大于100ng/ml； D 質粒抗性； E克隆和測序的引物序列。

進行SDS-PAGE檢測的時候蛋白的凈電荷會影響遷移率。帶電量高的蛋白會結合較少的SDS，因此阻礙了蛋白的泳動。富含脯氨酸的蛋白會在SDS-PAGE膠中移動得特別慢。但是如果蛋白的等電點在5-9之間，并且組成的氨基酸組分沒有明顯的偏好，那么目的蛋白遷移率與預期相差較遠就很有可能不是由于凝膠電泳造成的。這個時候最好利用C-端或者N-端的標簽進行Western Blot，看是否由于蛋白被蛋白酶降解而導致多條目的條帶或者比預期小很多的條帶出現(xiàn)。如果蛋白酶過高可以嘗試換個缺陷菌株。

（1）所有操作盡量在冰上操作，以避免蛋白質發(fā)生變性； （2）根據(jù)自己的需要選擇不同的表達載體，并注意不同的表達載體上的融合標簽和攜帶的抗性基因，其中有些標簽是可以去除的。 （3）構建好的載體最好進行測序驗證，保證讀碼框正確，即沒有移碼。 （4）長期保存的pET重組子在高濃度甘油中會導致質粒不穩(wěn)定。 （5）37 ℃生長常常會使一些蛋白累積形成包涵體，而30 ℃生長則可能產(chǎn)生可溶的和有活性的蛋白。在某些情況下，低溫（15－20℃）延長誘導時間可以使溶解性蛋白的產(chǎn)量達到最大。 （6）進行SDS-PAGE分析時，需優(yōu)化電泳上樣體積。

（1） 選擇正確的表達載體與表達菌株，基于T7 啟動子的載體（如pET 系列載體）應選用BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS、Rosetta(DE3) 等菌株。不是基于T7 啟動子的表達載體（如帶有tac 啟動子的pGEX、pMal 系列表達載體）應選用BL21 表達菌株。對細胞有毒性的蛋白，應該選用背景表達低、嚴緊調(diào)控誘導的菌株，如BL21(DE3)pLysS 菌株。 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白，應該選用Rosetta(DE3) 等菌株。 （2）嘗試不同的表達系統(tǒng)與菌株 不同的蛋白，對不同載體與菌株的偏好不同，如果某一表達系統(tǒng)無法通過優(yōu)化誘導表達條件得到明顯改善，可以更換其它的菌株或表達載體。 （3）表達條件的優(yōu)化，選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白，在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖（0.1%~0.5%），可以明顯提高表達量。較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間，一般可以加快表達的速度，促進目的蛋白的積累，從而提高表達量。但是可能會降低可溶蛋白的表達量，形成包涵體。菌體的生長狀態(tài)對蛋白表達有很大的影響，可以通過測量菌液的OD 值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白，應在菌液的對數(shù)生長期（OD ≈ 0.5）進行誘導。

無論是大腸桿菌的上清還是包涵體表達或者是其他系統(tǒng)表達菌不保證蛋白活性，對于大腸桿菌包涵體表達蛋白保證蛋白最終保存于不含變性劑的緩沖中，但是不保證活性。

包涵體一般為PH8.0的TE緩沖液，上清一般為PH8.0的NT0緩沖液。

初級文庫和次級文庫主要針對invitrogene getway系統(tǒng)而言。 初級文庫：得到的dsCDNA兩端添加B1,B2的接頭后，通過BP反應構建到donor載體（PDONR221）上，得到的初級文庫的同源臂通過重構命名為L1,L2，可以與有R1,R2同源臂的其他載體實現(xiàn)一步法構建，形成其他類型的文庫，如核膜文庫的轉換； 次級文庫：次級文庫用的載體為PDEST22,包含同源臂R1,R2，將構建PDONR221的初級文庫，通過LR反應，構建到PDEST22載體上，形成次級文庫。 結論：金開瑞的文庫主要采用的是直接構建到酵母雜交的文庫質粒上，最終交付的為工作文庫（即次級文庫）。invitrogene getway構建的文庫因涉及到初級和次級文庫，費用會更高一些，而周期也會相對長一些。

Gateway： 優(yōu)點： 1.cDNA采用單鏈直接合成后補齊缺口的方式獲得，cDNA片段的長度可以控制到1500bp左右； 2.把文庫構建到大腸桿菌，便于獲得文庫質粒； 3.方便一步法獲得不同載體的次級文庫； 缺點： 1.樣本的需求量很大（一般需要10-20g樣本），對于珍貴的樣本沒有辦法實現(xiàn)。 2.文庫構建的時間周期一般為4周，是SMART技術的一倍； 3.3’端的接頭采取引物合成的辦法帶上去，同時3’端末端引物添加Biotin修飾減少5’端接頭錯誤添加，但是依然有10%的概率會錯誤把5’端接頭添加到3’端末端，且方向正確的接頭添加的效率只有70%。 4.BP反應和LR反應效率最多是80%。 5.成本很高； Infusin體外重組優(yōu)點： 1.可以把文庫構建到大腸桿菌，便于獲得文庫質粒； 2.改進的Infusin體外重組相對于T4連接酶陽性率較高。 3.不需要酶切外源片段，避免含有相應酶切位點的樣本克隆丟失。 4.改進的Infusin體外重組方案采取PCR擴增的辦法獲得線性化載體然后去甲基化的辦法去除背景環(huán)形質粒，避免形成空載體轉化子。 缺點：Infusin酶和長距離PCR擴增線性化載體的酶比較貴。

?關于文庫片段長度，是可以按照客戶要求進行調(diào)整的，700bp，1000bp甚至1500bp以上我們都是可以實現(xiàn)的。最重要的還是需要考慮后續(xù)的文庫篩選，如果客戶的待篩選的與誘餌互作的獵物蛋白大小在800bp左右的，可能會由于客戶追求的大片段（1000bp以上）導致結果偏少，不能有效的為客戶后續(xù)研究方向提供有力的依據(jù)。所以在客戶提到片段大小時，約定好風險。目前我們合同中約定的是插入片段PCR鑒定80%在750bp以上，是一個相對適宜的片段長度。

均一化cDNA文庫：是指某一特定組織或細胞的所有表達基因均包含其中,且在cDNA文庫中表達基因對應的cDNA的拷貝數(shù)相等或接近。減少冗余轉錄物的拷貝而增加低豐度轉錄物的拷貝而構建的cDNA文庫。簡單說就是降低高峰度的核酸，這樣低峰度核酸就會占比高一些。均一化cDNA文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫的篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和分析。 均一化cDNA文庫是克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫的篩選和分析帶來障礙的有效措施，有利于研究基因的表達和分析。現(xiàn)在，在構建均一化cDNA文庫中至少有兩種主要的觀點。一種是基于復性動力學的原理，高豐度的cDNA在退火下復性速度快，而低豐度的cDNA復性要很長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種是基于基因組DNA在拷貝數(shù)上具有相對均一化的性質，通過cDNA和DNA的飽和雜交而降低在文庫中高拷貝存在的cDNA的豐度。 三框文庫：氨基酸對應三個密碼子，文庫中CDNA的片段大小是隨機的，讀碼框也是隨機的，例如ATG，有可能是從A開始翻譯，也有可能是從T或G開始翻譯，這種情況下就只會出現(xiàn)一個正確的讀碼，如果客戶感興趣的基因恰好移碼了，這樣就會提前終止，篩選也不可能被篩出來。三框通過人為的引入一個和兩個堿基，使每個移碼的基因都能正確的被讀出來。傳統(tǒng)的三框文庫均是通過引物的方式人為引入突變的，金開瑞采用載體改造的方式在載體上引入三個不同的讀碼框突變。這樣的三框文庫構建只用合成一份雙鏈cDNA,cDNA的合成純化均是在同樣的反應條件下進行的，可以完全保證三框文庫的片段長度，文庫滴度等信息的完全一致性，減少三框文庫的差異對篩選結果的影響。 金開瑞三框文庫：傳統(tǒng)的三框文庫均是通過引物的方式人為引入突變的，金開瑞采用載體改造的方式在載體上引入三個不同的讀碼框突變。這樣的三框文庫構建只用合成一份雙鏈cDNA,cDNA的合成純化均是在同樣的反應條件下進行的，可以完全保證三框文庫的片段長度，文庫滴度等信息的完全一致性，減少三框文庫的差異對篩選結果的影響。

我們?nèi)蛭膸鞓嫿ǖ碾p鏈cDNA是采用一套處理，處理量是單框的三倍，三個改造的不同讀碼框的酶切載體也是分別定量后混合做infusine連接的。所以理論上我們的三框處理的文庫滴度是非三框處理的文庫滴度的三倍。