客戶文章分享：在假單胞菌pf- 5中Hfq對lipA表達的調控作用
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2017-12-14 16:25:22
題目：The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5
期刊：Scientific Reports
影響因子：4.847 4.259
合作技術：EMSA
研究背景
脂肪酶是一種重要的工業酶，它存在于多種動物、植物和微生物中。商業脂肪酶主要來源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、飲料、石油、洗滌劑、化妝品、紙張、污染控制和生物能源工業。然而，傳統發酵條件的優化也不能克服細菌脂肪酶的生產過程中的問題。因此為了解決這些問題，有必要闡明其對脂肪酶的基因表達調控的分子機制。
假單胞菌脂肪酶是一種被研究的較清楚的脂肪酶。然而很少有針對脂肪酶表達調控的機制進行研究。Hfq是一種廣泛調控蛋白，能夠影響細菌生存的各種生理過程，控制多種基因的表達，調節細菌的蠕動，參與細菌群感應系統的管理。在本研究中，通過敲除或過表達hfq和rsmY基因，研究Hfq對脂肪酶表達的調控。研究發現，Hfq在轉錄水平和翻譯水平調節脂肪酶的表達，主要表現在轉錄水平的調控。同時Hfq還調控rsmY的表達及維持rsmY的穩定性。將Hfq / rsmY雙基因敲除，發現hfq可以直接結合rsmY來調控脂肪酶的激活。總之，這項研究表明在假單胞菌pf - 5中，Hfq通過在轉錄水平上調控rsmY的表達來影響脂肪酶的表達。
研究內容及結果
為了研究Hfq和lipA之間的關系，本文先通過同源重組的方法敲除及突變hfq基因，得到四個基因的突變株。并通過PCR的方法檢測基因敲降成功。將hfq突變后檢測了Pf-5的生長、脂肪酶的表達及活性，同時檢測了β-半乳糖苷酶的活性。實驗結果顯示hfq被突變后，單胞菌Pf-5生長水平受到抑制，脂肪酶轉錄水平表達受到抑制，同時脂肪酶活性顯著降低，β-半乳糖苷酶的活性也顯著降低。
期刊：Scientific Reports
影響因子：4.847 4.259
合作技術：EMSA
研究背景
脂肪酶是一種重要的工業酶，它存在于多種動物、植物和微生物中。商業脂肪酶主要來源于微生物。目前，脂肪酶被用于食品、飲料、石油、洗滌劑、化妝品、紙張、污染控制和生物能源工業。然而，傳統發酵條件的優化也不能克服細菌脂肪酶的生產過程中的問題。因此為了解決這些問題，有必要闡明其對脂肪酶的基因表達調控的分子機制。
假單胞菌脂肪酶是一種被研究的較清楚的脂肪酶。然而很少有針對脂肪酶表達調控的機制進行研究。Hfq是一種廣泛調控蛋白，能夠影響細菌生存的各種生理過程，控制多種基因的表達，調節細菌的蠕動，參與細菌群感應系統的管理。在本研究中，通過敲除或過表達hfq和rsmY基因，研究Hfq對脂肪酶表達的調控。研究發現，Hfq在轉錄水平和翻譯水平調節脂肪酶的表達，主要表現在轉錄水平的調控。同時Hfq還調控rsmY的表達及維持rsmY的穩定性。將Hfq / rsmY雙基因敲除，發現hfq可以直接結合rsmY來調控脂肪酶的激活。總之，這項研究表明在假單胞菌pf - 5中，Hfq通過在轉錄水平上調控rsmY的表達來影響脂肪酶的表達。
研究內容及結果
為了研究Hfq和lipA之間的關系，本文先通過同源重組的方法敲除及突變hfq基因，得到四個基因的突變株。并通過PCR的方法檢測基因敲降成功。將hfq突變后檢測了Pf-5的生長、脂肪酶的表達及活性，同時檢測了β-半乳糖苷酶的活性。實驗結果顯示hfq被突變后，單胞菌Pf-5生長水平受到抑制，脂肪酶轉錄水平表達受到抑制，同時脂肪酶活性顯著降低，β-半乳糖苷酶的活性也顯著降低。
在野生型假單胞菌pf- 5中，通過同源重組的方法過表達hfq，恢復了hfq突變體中脂肪酶的相對活性，結果表明hfq基因敲除在啟動子水平上影響脂肪酶表達以及活性。此外，在hfq突變型中過表達hfq后檢測脂肪酶和β-半乳糖苷酶的活性，結果顯示與野生型相比，這兩種酶的活性都恢復了。這些結果說明hfq在轉錄水平和翻譯水平參與lipA的表達以及脂肪酶表達的調控。
將phrs、rsmA，rsmE、remY、rsmZ的啟動子構建到lacZ報告基因的啟動子區域，轉染進hfq敲降后的假單胞菌，檢測β-半乳糖苷酶活性。結果顯示，轉染phrs、rsmA，rsmE重組質粒后β-半乳糖苷酶的活性沒有變化，rsmZ的活性發生了輕微的變化，而rsmY的活性變化很明顯。這些結果表明hfq可能通過remY或rsmZ影響lipA的表達。
使用純化后的hfq蛋白，通過EMSA實驗進一步研究hfq與rsmY是否結合。EMSA實驗結果顯示hfq不能與rsmA、rsmE、rsmZ的啟動子序列結合，但是可以與rsmY結合。競爭性EMSA實驗結果顯示，隨著非標記rsmY探針濃度增加，與hfq蛋白結合的標記探針越來越少，這個結果說明hfq蛋白可以與rsmY結合。
據報道，Hfq和rsmY的結合可以維持rsmY的穩定。然而，在pf - 5中，Hfq沒有被研究過。因此本文先研究了利福平處理后，pf-5野生型和hfq突變株中rsmY的穩定性變化。結果表明，與野生型相比，hfq突變體中rsmY的穩定性明顯降低。這個結果顯示Hfq通過調節rsmY的穩定性來影響表達rsmY，進而影響脂肪酶的表達。
通過PCR確定rsmY基因被敲除后(圖6A)，對脂肪酶表達進行了測定，驗證了rsmY在調節脂肪酶表達中的作用。實驗結果hfq被敲除的細胞中脂肪酶表達量減少。hfq和rsmY 都被敲除的細胞內，脂肪酶表達量顯著下調(圖6B和C)。此外，在hfq突變體中，將rsmY恢復表達，結果顯示脂肪酶的表達水平與野生型表達水平相似。在野生型和hfq突變型菌株中，過表達rsmY后lipA的表達水平都顯著上調。
文章小結
1. Hfq基因被敲降后，pf-5菌株中脂肪酶的表達量顯著下調，同時細菌生長受到抑制，說明hfq調控lipA的表達和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通過remY或rsmZ影響lipA的表達。
3. EMSA實驗表明hfq蛋白可以與rsmY結合。
4. Hfq通過調節rsmY的穩定性來影響表達rsmY，進而影響脂肪酶的表達。
5. Hfq通過在轉錄水平上調控rsmY的表達來影響脂肪酶的表達。
解析文獻
Wu Liu, Menggang Li, et al. The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017).
1. Hfq基因被敲降后，pf-5菌株中脂肪酶的表達量顯著下調，同時細菌生長受到抑制，說明hfq調控lipA的表達和脂肪酶的活性。
2. hfq可能通過remY或rsmZ影響lipA的表達。
3. EMSA實驗表明hfq蛋白可以與rsmY結合。
4. Hfq通過調節rsmY的穩定性來影響表達rsmY，進而影響脂肪酶的表達。
5. Hfq通過在轉錄水平上調控rsmY的表達來影響脂肪酶的表達。
解析文獻
Wu Liu, Menggang Li, et al. The role of Hfq in regulation of lipA expression in Pseudomonas protegens Pf-5. Scientific. Reports. 7 (1) :10356(2017).
參考文獻
1. Houde, A., Kademi, A. & Leblanc, D. Lipases and their industrial applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118, 155–70(2004).
2. Soberon-Chavez, G. & Palmeros, B. Pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. Crit. Rev. Microbiol. 20, 95–105 (1994).
3. Krzeslak, J., Gerritse, G., van Merkerk, R., Cool, R. H. & Quax, W. J. Lipase expression in Pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1402–11 (2008).
4. Rosenau, F. & Jaeger, K. Bacterial lipases from Pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. Biochimie82, 1023–32 (2000).
1. Houde, A., Kademi, A. & Leblanc, D. Lipases and their industrial applications: an overview. Appl. Biochem. Biotechnol. 118, 155–70(2004).
2. Soberon-Chavez, G. & Palmeros, B. Pseudomonas lipases: molecular genetics and potential industrial applications. Crit. Rev. Microbiol. 20, 95–105 (1994).
3. Krzeslak, J., Gerritse, G., van Merkerk, R., Cool, R. H. & Quax, W. J. Lipase expression in Pseudomonas alcaligenes is under the control of a two-component regulatory system. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1402–11 (2008).
4. Rosenau, F. & Jaeger, K. Bacterial lipases from Pseudomonas: regulation of gene expression and mechanisms of secretion. Biochimie82, 1023–32 (2000).
X 
