客戶文章分享：番茄轉錄因子SlHZ24通過對D-甘露糖/L半乳糖通路的正調節促進抗壞血酸積累
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2017-12-29 15:58:19
基本信息
題目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
影響因子：5.901
實驗技術：酵母單雜交、酵母雙雜交、雙螢光素酶檢測、EMSA、qPCR
合作技術：EMSA
研究背景
抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化劑，可以清除植物在脅迫條件下產生的活性氧。本文通過酵母單雜交技術、瞬時表達和EMSA實驗驗證了SlHZ24和SIGMP3啟動子結合，且SlHZ24表達水平與AsA積累呈正相關特性。相反，通過RNAi技術導致AsA表達量降低。SlHZ24同時也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說明抗壞血酸合成為多靶點調控。SlHZ24過表達植株對氧化應激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進抗壞血酸的合成，提高了植株對氧化應激的耐受性。
研究內容及結果
1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族
本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galactose途徑中關鍵GMP基因為切入點。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據報道GMP家族中只有過表達SIGMP3提高了抗壞血酸的表達且改善了氧化應激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動子作用調節抗壞血酸的轉錄因子，共找到25個潛在蛋白，確認SlHZ24 為研究對象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結構域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進化分析的結果也說明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。
題目：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway
期刊：The Plant Journal
影響因子：5.901
實驗技術：酵母單雜交、酵母雙雜交、雙螢光素酶檢測、EMSA、qPCR
合作技術：EMSA
研究背景
抗壞血酸（AsA）是一種抗氧化劑，可以清除植物在脅迫條件下產生的活性氧。本文通過酵母單雜交技術、瞬時表達和EMSA實驗驗證了SlHZ24和SIGMP3啟動子結合，且SlHZ24表達水平與AsA積累呈正相關特性。相反，通過RNAi技術導致AsA表達量降低。SlHZ24同時也影響D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達，比如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，說明抗壞血酸合成為多靶點調控。SlHZ24過表達植株對氧化應激的敏感性降低，作者推斷SlHZ24促進抗壞血酸的合成，提高了植株對氧化應激的耐受性。
研究內容及結果
1. SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白家族
本文以維生素C合成主要途徑D-mannose/L-galactose途徑中關鍵GMP基因為切入點。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了很重要的角色，據報道GMP家族中只有過表達SIGMP3提高了抗壞血酸的表達且改善了氧化應激耐受性。因此，本文使用酵母單雜交找尋與SIGMP3啟動子作用調節抗壞血酸的轉錄因子，共找到25個潛在蛋白，確認SlHZ24 為研究對象。序列分析顯示SlHZ24含有HD和LZ結構域（圖1a），且與其他HD-Zip I蛋白高度同源（圖1b）。進化分析的結果也說明SlHZ24與擬南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24屬于HD-Zip I蛋白。
2. 酵母雙/單雜交驗證SlHZ24反式激活作用
使用酵母雙雜交實驗驗證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實驗組可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生長，而對照組不能生長（圖2a）。使用酵母單雜交實驗驗證了不同長度SlHZ24和SIGMP3啟動子的作用，其中SlHZ24全長、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結構域表現為正常生長，N1不包含HD結構域表現為細胞不生長，N2包含不完整的HD結構域表現為生長緩慢，說明HD結構域為互做結構域（圖2a）。
使用酵母雙雜交實驗驗證了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的實驗組可以在SD/–Trp–His–Ade平板上生長，而對照組不能生長（圖2a）。使用酵母單雜交實驗驗證了不同長度SlHZ24和SIGMP3啟動子的作用，其中SlHZ24全長、N3、N4、N5、N6、N7包含HD結構域表現為正常生長，N1不包含HD結構域表現為細胞不生長，N2包含不完整的HD結構域表現為生長緩慢，說明HD結構域為互做結構域（圖2a）。
3. 瞬轉及雙螢光素酶檢測驗證SlHZ24與SlGMP3啟動子結合
將SlGMP3啟動子分成4段進行雙螢光素酶檢測實驗（圖3a、3b），P1和P2啟動子區域檢測到熒光增強，實驗結果說明SlHZ24結合SlGMP3啟動子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結合區段。
將SlGMP3啟動子分成4段進行雙螢光素酶檢測實驗（圖3a、3b），P1和P2啟動子區域檢測到熒光增強，實驗結果說明SlHZ24結合SlGMP3啟動子的第二段序列，即-2411到-2313bp為結合區段。
4．進一步實驗驗證SlHZ24和SlGMP3結合
使用酵母單雜交實驗驗證不同的SlGMP3啟動子和SlHZ24的結合情況（圖4a），結果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動子的結合位點為-2411到-2313bp，突變實驗也證明了這個結果（圖4b）。EMSA實驗進一步證明了該結論（圖4c）。這些結果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結合來啟動下游表達。
使用酵母單雜交實驗驗證不同的SlGMP3啟動子和SlHZ24的結合情況（圖4a），結果顯示SlHZ24蛋白與SlGMP3啟動子的結合位點為-2411到-2313bp，突變實驗也證明了這個結果（圖4b）。EMSA實驗進一步證明了該結論（圖4c）。這些結果表明SlHZ24直接與SlGMP3的上游元件結合來啟動下游表達。
5. 不同番茄組織及轉基因番茄中SlGMP3和SlHZ24檢測
使用qPCR對番茄不同組織中的SlGMP3啟動子和SlHZ24的表達量進行了檢測，發現兩者都在莖和葉總的表達量較高（圖5a），說明SlHZ24正向調節SlGMP3表達。為了驗證SlHZ24對SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過表達和干擾轉基因番茄進行下一步實驗（圖5b）。
使用qPCR對番茄不同組織中的SlGMP3啟動子和SlHZ24的表達量進行了檢測，發現兩者都在莖和葉總的表達量較高（圖5a），說明SlHZ24正向調節SlGMP3表達。為了驗證SlHZ24對SlGMP3的影響，分別建立的SlHZ24過表達和干擾轉基因番茄進行下一步實驗（圖5b）。
6. SlHZ24通過調節SlGMP3表達來改變AsA的合成
對過表達、干擾番茄葉及果實中AsA的檢測（圖6a 、6b）實驗，說明SlHZ24在番茄葉和果實中同時調節抗壞血酸的合成。過表達SlHZ24的OX-13植株果實中SlGMP3基因的表達量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量顯著減少，而過表達SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6c）。對轉基因番茄中其他GMP家族基因的檢測結果說明SlHZ24可能調節多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。
對過表達、干擾番茄葉及果實中AsA的檢測（圖6a 、6b）實驗，說明SlHZ24在番茄葉和果實中同時調節抗壞血酸的合成。過表達SlHZ24的OX-13植株果實中SlGMP3基因的表達量明顯高于野生型，而干擾SlHZ24的KD-9植株果實中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6d）。有趣的是在干擾SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量顯著減少，而過表達SlHZ24的植株葉子中SlGMP3基因的表達量變化不大（圖6c）。對轉基因番茄中其他GMP家族基因的檢測結果說明SlHZ24可能調節多種SIGMP基因（圖6c、圖6d）。
7. 番茄中AsA和SlGMP3檢測
為了檢測番茄果實成熟過程中SlHZ24如何影響SlGMP3，對不同時期果實的AsA和SlGMP3表達量進行了檢測（圖7a、7b），結果表明SlHZ24在番茄成熟的過程中可以調節SlGMP3的表達，其中以破色期果實調控效應最為顯著，除了紅果實成熟期。
為了檢測番茄果實成熟過程中SlHZ24如何影響SlGMP3，對不同時期果實的AsA和SlGMP3表達量進行了檢測（圖7a、7b），結果表明SlHZ24在番茄成熟的過程中可以調節SlGMP3的表達，其中以破色期果實調控效應最為顯著，除了紅果實成熟期。
8. SlHZ24轉基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表達檢測
使用qPCR對番茄的葉和果實進行了檢測（圖8a、8b），結果表明在野生型和轉基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達量發生了改變，顯示SlHZ24的多點協同調控作用。
使用qPCR對番茄的葉和果實進行了檢測（圖8a、8b），結果表明在野生型和轉基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表達量發生了改變，顯示SlHZ24的多點協同調控作用。
9. SIGME2、SIGGP啟動子實驗
使用EMSA實驗驗證轉錄因子SlHZ24和啟動子SIGME2、SIGGP有互做關系。
使用EMSA實驗驗證轉錄因子SlHZ24和啟動子SIGME2、SIGGP有互做關系。
10. SlHZ24光響應及氧化應激的作用
為了研究光對AsA的作用，作者對不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達量進行了檢測（圖10a、10b），結果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達也隨之提高。使用MV對轉基因番茄進行處理，同時對葉綠素和MDA濃度進行檢測，說明SIHZ24過表達可以提高植物對氧化應激的耐受性。
為了研究光對AsA的作用，作者對不同光處理番茄中的AsA和SIHZ24的表達量進行了檢測（圖10a、10b），結果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表達也隨之提高。使用MV對轉基因番茄進行處理，同時對葉綠素和MDA濃度進行檢測，說明SIHZ24過表達可以提高植物對氧化應激的耐受性。
文章小結
目前植物合成AsA基礎途徑已經明確，但對AsA合成代謝的調控機制知之甚少。本文研究了番茄轉錄因子SlHZ24結合SIGMP3啟動子從而增加AsA表達水平的機制，進而提高植物對氧化應激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類小分子抗氧化劑物質，能清除體內活性氧，增強有機體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進行。不過人類自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發現調控果實AsA積累的轉錄因子，對揭示AsA調控機制和未來品質改良具有重要意義。
解析文獻
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
參考文獻
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.
目前植物合成AsA基礎途徑已經明確，但對AsA合成代謝的調控機制知之甚少。本文研究了番茄轉錄因子SlHZ24結合SIGMP3啟動子從而增加AsA表達水平的機制，進而提高植物對氧化應激的耐受性。AsA（又稱維生素C），是生物體一類小分子抗氧化劑物質，能清除體內活性氧，增強有機體抗氧化能力，保證新陳代謝的正常進行。不過人類自身不能合成維生素C，必須從食物中攝取。本研究首次發現調控果實AsA積累的轉錄因子，對揭示AsA調控機制和未來品質改良具有重要意義。
解析文獻
Tixu Hu, Jie Ye, Peiwen Tao, et al.The tomato HDZip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal (2016) 85, 16–29.
參考文獻
1. Ariel, F.D., Manavella, P.A., Dezar, C.A. and Chan, R.L. (2007) The true story of the HD-Zip family. Trends Plant Sci. 12, 419–426.
2. Badejo, A.A., Tanaka, N. and Esaka, M. (2008) Analysis of GDP-D-mannose pyrophosphorylase gene promoter from acerola (Malpighia glabra) and increase in ascorbate content of transgenic tobacco expressing the acerola gene. Plant Cell Physiol. 49, 126–132.
3. Bombarely, A., Menda, N., Tecle, I.Y., Buels, R.M., Strickler, S., Fischer-York,T., Pujar, A., Leto, J., Gosselin, J. and Mueller, L.A. (2011) The Sol Genomics Network (solgenomics.net): growing tomatoes using Perl. Nucleic Acids Res. 39, D1149–D1155.
4. Bulley, S.M., Rassam, M., Hoser, D., Otto, W., Schunemann, N., Wright, M.,MacRae, E., Gleave, A. and Laing, W. (2009) Gene expression studies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates that GDP-Lgalactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis.J. Exp. Bot. 60, 765–778.
5. Bulley, S., Wright, M., Rommens, C. et al. (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol. J. 10, 390–397.
6. Cabello, J.V., Arce, A.L. and Chan, R.L. (2012) The homologous HD-Zip I transcription factors HaHB1 and AtHB13 confer cold tolerance via the induction of pathogenesis-related and glucanase proteins. Plant J. 69,141–153.
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