酵母雜交通關攻略

Q:利用去除激活域的轉錄因子X作為誘餌，篩選到互作蛋白Y。再利用X的全長蛋白導入AD載體，Y導入BD載體，共轉AH109的結果顯示不互作。怎么解析？

A:這個問題可以從兩個方面分析：1.確保第一次共轉化驗證是否是陽性，用Y2H菌株替換AH109試試，AH109菌株相對更容易產生假陽性；2.確保初次驗證是陽性結果，第二次驗證是陰性結果，猜測可能是融合的相應的BD和AD的結構域蛋白包裹了誘餌或者獵物蛋白結構域，因為酵母表達系統是真核系統，表達的蛋白是具有結構的非線性的構象，如果蛋白分子量不大，可以采用誘餌和獵物蛋白兩次串聯方式的構建，或者某個重要結構域重復串聯。

Q:如果誘餌可以直接激活報告基因，該如何處理？

A:為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3’AT/ABA進行背景抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有較大的毒性，后續可能會影響文庫篩選，因此在3’AT超過15mM，ABA超過1200ng/ml時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷，通過查閱文獻和相關數據庫，截去轉錄激活的區域，需要注意的是，截去的這一部分很有可能會影響到互作結果。

Q:酵母單雜誘餌啟動子我該選擇全長還是核心區域？

A:全長：優點：更接近于自然條件下的啟動環境；缺點：有時候過于長，導致構建具有一定的難度，更可能的產生自激活現象；
預測的核心元件（<20bp）：優點：核心元件用于后續的EMSA驗證試驗，對核心位點進行突變驗證啟動效果是否減弱，相對全長啟動子而言突變的區域較少操作更為方便；缺點：核心元件雖然是啟動的核心區域，但是啟動子的其他區域也可能是作為輔助元件而存在的，如果缺少這些部分就是非自然條件下的環境，可能產生假陰性；

Q:膜系統功能驗證是怎么做？

A:NMY51(PBT3-N-bait+post1-NubaI)此為功能驗證組，NubaI為野生型的ubiquitin的N端結構，保留了原始的三個I氨基酸結構，可以在不需要兩個蛋白產生相互作用的情況下兩個C端和N端的ubiquitin結構域結合在一起產生具有功能的ubiquitin，從而激活下游的報告基因。結論：在二缺平板上正常生長，說明共轉化成功，并在缺陷TDO+X-a-Gal的平板上顯藍色說明我們的bait構建的讀碼框正確（也就是我們構建的誘餌擴譜結構可以滿足篩選的需要）。并且我們的ubiquitin系統是存在功能的。

Q:膜蛋白酵母雙雜交過程需要注意的問題與細節？

A:膜蛋白的篩選是采用共轉化的方式進行的，篩選的假陽性率相對核蛋白的mating方式篩選假陽性率要低一些，但是共轉化篩選對轉化效率有要求，不然會產生假陰性。如果采用化學轉化對感受態轉化效率有一定的要求，至少達到10的4次方，感受態細胞的溶氧的提到（裝液量不超過1/5）對感受態的效率提高有幫助。電轉化感受態保存10%的甘油，轉化參數800v,15m轉化效率可以到10的5次方到6次方。

Q:請給個預測靶蛋白的網站，植物。

A:http://domine.utdallas.edu/cgi-bin/Domine
https://string-db.org/cgi/input.pl?sessionId=ksdvF3MraTE8&input_page_active_form=single_sequence

Q:相對其他公司而言，金開瑞在酵母雜交業務上具有什么樣的優勢？

A:從文庫構建來說：
文庫構建方式靈活：根據樣本的類型，提供的樣本量等方面考慮，可采用smart，geteway，infusion體外重組和T4體外連接等方式進行文庫構建；
文庫片段大小可控：根據客戶想要研究的蛋白類型大小控制片段的大小，以提高篩選到目標蛋白的可能性。如白細胞介素，生長因子類的小分子蛋白；轉錄因子，信號通路類的分子量稍大一些的蛋白；
單雙雜文庫通用：構建一種類型的文庫，可同時用于單雙雜篩選；

對于文庫篩選來說：
篩庫方式多樣：可采用matting或共轉的方式進行文庫篩選；
互作強弱可控化：提高（降低）篩選壓力，用于篩選出強（弱）相互作用的蛋白。
陽性結果進一步驗證：文庫篩選出的陽性結果，可進行點對點驗證進一步排除假陽性。

Q:酵母雜交年末有活動嗎？

A:有，建庫、篩庫、點對點都有活動，趕緊聯系您的對接銷售了解詳情吧。
 

Q:金開瑞所提到的三框文庫和均一化文庫具體指什么？與普通文庫相比有什么優勢嗎？

A:三框：氨基酸對應三個密碼子，文庫中CDNA的片段大小是隨機的，讀碼框也是隨機的，例如ATG，有可能是從A開始翻譯，也有可能是從T或G開始翻譯，這種情況下就只會出現一個正確的讀碼，三框通過人為的引入一個和兩個堿基，使每個移碼的基因都能正確的被讀出來，這樣得到的文庫即為一個相對較為完整。

均一化：組織樣本中有些基因mRNA含量會很高，而有些基因含量會很低。均一化主要是將高峰度的mRNA通過人為的處理將其在總樣本中的占比降下來，這樣低豐度的mRNA的占比自然就會升高。如果客戶感興趣的基因恰好屬于低豐度mRNA，那么在實現MRNA的均一性后，文庫篩選更有可能的篩出客戶的目的功能基因。要注意的是均一化不建議用于研究特殊處理后的樣本（如，病毒/細菌侵害，水脅迫等）。

Q:進行酵母雜交文庫篩選時得到的陽性結果，而進行點對點驗證卻出現陰性結果，是什么原因造成的呢？

A:可能有以下原因：

1) 酵母雜交本身也是存在假陽性的情況，有可能這兩個基因根本不互作，這樣在進行單獨的點對點驗證時自然也不會產生互作；

2) 有些互作為瞬時互作，在文庫篩選時可能捕捉導了互作，而在兩個基因進行單獨驗證時由于互作時間的原因，最終導致結果顯示為陰性；

3) 有些互作為間接互作，可能需要依靠第三個基因的作用，促進這兩個基因的互作。

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