在之前的文章中，我們總結了酵母雜交中的常見問題和解析，但是我們發現很多同學對自激活現象存在諸多疑問，那本期圖文我們將對自激活現象的產生原因以及應對策略進行詳細描述，希望能給大家帶來幫助。

酵母轉錄因子（GAL4）包括：

①DNA 結合結構域（DNA binding domain，BD；識別結合GAL4效應基因上游激活序列UAS）

②轉錄激活域（transcription activation domain ，AD；與轉錄機構中的其他成分結合作用啟動下游的基因進行轉錄）

技術原理：2個結構域彼此分離但為功能必需的結構域，單獨作用不能激活轉錄反應，當二者在空間上充分接近時，則呈現完整的GAL4轉錄因子活性使啟動子下游基因（抗性篩選、藍白斑篩選、營養缺陷型篩選等）得到轉錄。把需要檢測的蛋白質分別與BD和AD融合，形成 bait 融合蛋白（BD- bait）和 prey 融合蛋白（AD-prey），如果 bait 和 prey發生相互作用，就會促使 BD 和 AD 在空間上相互接近，形成完整的GAL4，激活報告基因的轉錄。

一般情況下單獨的BD可以與GAL4上游活化序列結合，但不能引起轉錄。如果，把一段具有轉錄激活活性的基因構建到BD的載體上，BD- bait會形成完整的激活轉錄作用，引起下游報告基因的轉錄和表達，這就是酵母雜交的自激活現象。那對于BD- bait可以直接激活報告基因，研究者們都在思考怎樣解決問題。

雙雜有4個獨立的報告基因:
(1) AUR1-C: 是AUR1 的突變體，編碼肌醇磷酸化酰胺合成酶，表達產物可以使酵母菌對AbA產生抗性，只有產生蛋白互作的時候才會被激活。
(2) HIS3:Y2HGold不能合成組氨酸，因此不能在缺乏這種必需氨基酸的培養基上生長。兩種蛋白質相互作用時，His3表達被激活，允許酵母菌合成組氨酸并在其最基礎的培養基上生長，3’AT作為HIS的抑制劑。
(3) ADE2: Y2HGold不能在不含腺嘌呤的最基礎培養基上生長。當兩種蛋白質相互作用時，Ade2表達被激活，使這些細胞在Ade最小培養基上生長。
(4) MEL1：編碼α-半乳糖苷酶，由于蛋白間的相互作用，α-半乳糖苷酶由酵母細胞表達和分泌，使底物X-α-Gal變成藍色。

為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3’AT或者AbA進行自激活的抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有一定的影響，濃度過高可能會影響后續的文庫篩選及雜交驗證，因此在3’AT超過15mM，AbA超過1200ng/ml時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷。

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