在現(xiàn)代生命科學研究的舞臺上，小干擾RNA（Small Interfering RNA, siRNA）猶如一把精準調(diào)控基因表達的“手術(shù)刀”，以其高度特異性和高效性在基因沉默領(lǐng)域展現(xiàn)出了無可比擬的優(yōu)勢。siRNA，這一由雙鏈RNA分子組成的短片段，通過與細胞內(nèi)特定mRNA序列精確互補配對，觸發(fā)RNA干擾（RNA Interference, RNAi）機制，有效抑制對應基因的翻譯，從而實現(xiàn)對基因功能的臨時、可逆性關(guān)閉。這一關(guān)鍵性技術(shù)不僅為研究人員打開了深入探究基因功能、解析復雜生物學過程的大門，更為疾病的分子機制研究、藥物靶點篩選以及基因療法開發(fā)提供了強大的工具。

圖源：https://www.cnki.net

    siRNA的應用領(lǐng)域廣泛而深遠，無論是基礎(chǔ)研究中的基因功能驗證、信號通路解析，還是轉(zhuǎn)化研究中的藥物靶標驗證、疾病模型構(gòu)建，乃至臨床研究中的個性化治療探索，siRNA都以其獨特的技術(shù)優(yōu)勢發(fā)揮著不可或缺的作用。其高度定制化特性使得研究人員能夠針對任何已知基因設(shè)計并合成特定siRNA，實現(xiàn)精準的基因敲低，極大地推動了生命科學各個領(lǐng)域的研究進程。

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    然而，盡管siRNA技術(shù)的潛力與價值毋庸置疑，實際應用過程中仍會面臨諸如轉(zhuǎn)染效率、實驗重復性、基因干擾效果等一系列技術(shù)挑戰(zhàn)。這些問題的妥善解決對于充分發(fā)揮siRNA技術(shù)的潛力，確保研究結(jié)果的準確性和可靠性至關(guān)重要。武漢金開瑞生物工程有限公司是一家專業(yè)致力于為全球制藥企業(yè)、診斷試劑企業(yè)、科研試劑研發(fā)企業(yè)、高校和科研院所以及大型醫(yī)院提供核酸及蛋白相關(guān)研究技術(shù)服務的高新技術(shù)企業(yè)。自2013年成立以來，我們已經(jīng)積累了超過10年的項目經(jīng)驗，并擁有專業(yè)的技術(shù)團隊。接下來，我們將針對siRNA研究中常見的問題進行深入探討，并提供科學、實用的解答與應對策略。

    Q：siRNA轉(zhuǎn)染常見問題與建議有哪些？

    A：為保證誘餌蛋白功能的完整性，首先我們會考慮用3’AT/ABA進行背景抑制，但是由于這兩種試劑對酵母生長具有較大的毒性，后續(xù)可能會影響文庫篩選，因此在3’AT超過15mM，ABA超過1200ng/ml時我們會考慮將誘餌蛋白進行截斷，通過查閱文獻和相關(guān)數(shù)據(jù)庫，截去轉(zhuǎn)錄激活的區(qū)域，但是需要注意的是，截去的這一部分很有可能會影響到互作結(jié)果。

    Q：siRNA轉(zhuǎn)染常見問題與建議有哪些？

    A：

    Q：我們需要提供什么信息用于 siRNA 的合成？金開瑞可以幫助免費設(shè)計嗎？

    A：您需要準確地提供 siRNA 的 19 個核苷酸的靶序列和懸垂的合成物，或者您也可以提供相應地基因的 Gene ID 或者 Accession Number，由金開瑞公司技術(shù)人員為您免費設(shè)計。
 

    Q：用 100nM 的 siRNA 轉(zhuǎn)染時只得到 50%沉默效率，我可以將 siRNA 的濃度增加到 200nM 甚至400nM 嗎？

    A：增加 siRNA 的濃度一般不能改進沉默效率。高濃度的 siRNA 將可能導致去靶作用和對細胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率來自于合理的設(shè)計，在 100nM 甚至更低的濃度都可能有 75%的沉默效率。另外，低的轉(zhuǎn)染效率會導致低的沉默效率，建議您更進一步優(yōu)化 siRNA 的導入條件。
 

    Q：沉默效果不理想，應該如何處理？

    A：最常見的影響沉默效果的兩個原因是：轉(zhuǎn)染效率低和 siRNA 序列設(shè)計的效果不理想。如果您初次使用 siRNA 或采用了新的細胞系，并發(fā)現(xiàn)沉默效果不佳，我們建議您對轉(zhuǎn)染效率進行檢測，并選擇優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。如果您已經(jīng)對實驗轉(zhuǎn)染條件進行優(yōu)化但是問題依然存在，我們建議您換用另一種轉(zhuǎn)染試劑或是采用其他技術(shù)，這也許能提高轉(zhuǎn)染效率。如果已經(jīng)提高了轉(zhuǎn)染效率但是沉默效果仍然未達到要求，可能是因為siRNA序列設(shè)計的效果不理想。
 

    Q：一定需要陰性對照嗎？

    A：是，陰性對照是 RNA 干擾實驗中不可缺少的。由于在超過 200nM 的濃度下，siRNA 有可能會導致非特異性的壓力反應，在實驗體系中必需設(shè)置陰性對照。它能夠幫助我們確認基因表達水平的降低是否是序列特異性的 RNAi 的結(jié)果。由于 siRNA 的合成方法和工藝以及轉(zhuǎn)染試劑等因素可能導致廣泛的基因沉默現(xiàn)象。如果沒有陰性對照，研究人員很可能錯誤地將廣泛的、非特異性基因沉默當作由 RNAi 引起的基因特異性沉默。
 

    Q：常用的陰性對照有哪些類型？

    A：常用的陰性對照大體分為兩種，一種是使用通用陰性對照序列，該序列已經(jīng)被上千篇文章使用；另一類是使用和靶基因 siRNA 打亂序列的 siRNA 作為陰性對照，這樣的陰性對照和通用序列相比較，一方面合成是按照定制產(chǎn)品價格合成的，另一方面，由于打亂序列是沒有經(jīng)過驗證的序列，有可能會產(chǎn)生 off target 現(xiàn)象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作為陰性對照。
 

    Q：在陰性對照體系中和實驗體系中觀察到同樣的實驗結(jié)果，這是什么原因？

    A：這個結(jié)果充分說明了設(shè)置陰性對照的必要性。該結(jié)果表明您所觀察到的表型不是序列特異性knockdown產(chǎn)生的表型，您需要降低 siRNA 的工作濃度。
 

    Q：用于對照的 siRNA 的最佳濃度是多少？

    A：陽性對照和陰性對照的 siRNA 的濃度都應該與基因特異性的 siRNA 的濃度相同。
 

    Q：在 siRNA 上進行標記的最佳位點在哪里？

    A：反義鏈的 5'端標記會影響 siRNA 的沉默活性，所以不推薦標記這個位點。在其他三個末端進行標記對沉默活性幾乎沒有影響。有研究表明正義鏈的 5'端標記是最有效的化學合成位點。
 

    Q：金開瑞siRNA套餐有什么優(yōu)勢？

    A：訂購金開瑞siRNA套餐，資深技術(shù)設(shè)計siRNA，在保證細胞轉(zhuǎn)染效率（≥80%）的前提下，siRNA可達到70%以上的沉默效果。若經(jīng)qRT-PCR鑒定，套餐中3對siRNA均未達到70%或以上的沉默效果，金開瑞將根據(jù)您提供的實驗結(jié)果進行分析。如核實為siRNA設(shè)計問題，則重新設(shè)計并免費合成針對靶基因的另外3對siRNA。特殊物種（除人，小鼠，大鼠以外）及l(fā)ncRNA除外。
 

    Q：金開瑞的siRNA套餐包含哪些內(nèi)容？

    A：金開瑞的siRNA套餐里面含有針對目的基因設(shè)計的3條siRNA，贈送普通NC，NC-FAM，陽性對照。

    1、NC-FAM：實驗開始前，請先用NC-FAM進行預實驗，根據(jù)您用的轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染NC-FAM，換液后可通過熒光直接觀察明確最佳轉(zhuǎn)染效率后再進行后續(xù)實驗安排。一般情況FAM在轉(zhuǎn)染后48小時內(nèi)就會淬滅。

    2、陽性對照用途：提供的GAPDH siRNA均為驗證過有效的siRNA。如果實驗組和GAPDH組都未出現(xiàn)有效下調(diào)則有可能實驗轉(zhuǎn)染步驟存在問題，請優(yōu)化實驗條件后再進行相應實驗。

    3、NC：用于確保實驗過程中其它因素導致了目的基因的RNA水平變化。NC組實驗結(jié)果應與空白組實驗結(jié)果一致。
 

    Q：siRNA 導入到細胞內(nèi)選哪種方法？

    A：使用什么樣的轉(zhuǎn)染方法，很大程度上取決于您使用的細胞系：1.貼壁的、易轉(zhuǎn)染的細胞，我們推薦使用 Lipofectamin 2000 或 siRNA Mate 轉(zhuǎn)染試劑。2.懸浮的或原代的細胞，我們推薦使用電擊轉(zhuǎn)化方法；3.電擊轉(zhuǎn)化效率仍然很低的細胞，需要選擇載體系統(tǒng)。
 

    Q：剛開始接觸 RNA 干擾技術(shù)，經(jīng)費有限，如何確定研究體系？

    A：在開始 RNA干擾研究之初，需要確定以下幾個方面：使用化學合成的 siRNA 還是使用載體構(gòu)建 shRNA？我們推薦使用化學合成的方法來篩選有效的目的片段，然后把篩選出來的目的片段插入到載體，進行抗性篩選，得到穩(wěn)定表達的細胞株，再做長期研究。
 

    Q：反義核酸和 RNAi 有何差異？

    A：反義核酸和 RNAi 從作用原理到使用的范圍都有很大差異。這里只能做一個簡單的介紹：從原理上說，反義核酸是一段與靶基因配對的單鏈 DNA 或類似 DNA 的片段與靶基因結(jié)合，結(jié)果阻止靶基因的轉(zhuǎn)錄或是翻譯，以往的研究表明在反義核酸的研究中，序列的有效性和有效序列的非特異性往往有比較高的正相關(guān)性，這就在一定程度上限制了反義核酸的應用。RNAi的作用機理是雙鏈的RNA進入細胞內(nèi)，導致靶基因的切割和降解。siRNA 的序列可以選擇在高度特異針對靶基因的位置，也就為RNAi作為藥物研究提供了高效、低副作用的空間。自從RNAi技術(shù)問世以來，國外很多專業(yè)從事反義核酸研究的公司都紛紛轉(zhuǎn)向 RNAi研究。
 

    在致力于推動siRNA技術(shù)廣泛應用，助力科研人員攻克研究難題的過程中，我們深感責任重大。為了讓更多科研工作者能夠便捷、經(jīng)濟地獲取高質(zhì)量siRNA產(chǎn)品，享受到前沿基因沉默技術(shù)帶來的科研紅利，2024/5/1-2024/6/30，我們將特別推出一場史無前例的siRNA促銷活動，全年最低，絕對的驚喜價！詳情請聯(lián)系您的對接銷售或官方客服，期待與您攜手合作，共同開啟基因沉默研究的新篇章！

參考文獻：
●J. Shen, W. Zhang, R. Qi, et al., Engineering functional inorganic-organic hybrid systems: advances in siRNA therapeutics [J]. Chemical Society Reviews, 2018, Vol.47 (6): 1969-1995.
●https://www.cnki.net
●RNAi 技術(shù)在抑制 H B V 復制和表達中的應用