知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2024-06-05 09:07:00
蛋白間相互作用是細胞各種基本功能的主要完成者，參與幾乎所有的重要生命活動。因此，蛋白-蛋白相互作用研究以及建立相互作用的關系網絡圖，具有十分重要的意義，也是目前蛋白質研究領域的熱點。
Co-IP（免疫共沉淀，co-inmunoprecipitation）是經典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復合體的一項技術，能夠特異性富集所研究的目的蛋白。由于過程中采用了非變性條件，保留了互作及復合體的細胞內狀態。相對于酵母雙雜交、pull down等方法，其特色之一便是捕獲的蛋白互作發生在所研究的特定組織細胞內，保存了互作蛋白及復合體的“內源”狀態。
Co-IP實驗原理：
以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。
Co-IP實驗優勢：
a) 取材可以選擇該目的蛋白所在物種、特定組織、細胞，因此CoIP能夠反應該蛋白在天然組織細胞狀態下存在的互作關系蛋白；
b) 找出整個復合體中直接/間接互作的多個蛋白，研究復合體組成；
c) 通過與質譜鑒定連用可以初篩到一系列未知蛋白，再通過其他技術進一步驗證。
Co-IP實驗注意事項
a)需要特異性IP級別誘餌蛋白抗體（重點）；
b)如果沒有特異性抗體，則需要考慮構建重組標簽質粒，用標簽抗體進行CoIP實驗；
c)樣品種類實驗風險：過表達細胞樣品<細胞樣品<動物組織樣品<植物樣品（通常為轉基因植物，標簽抗體也很難達到特異性富集）；
d)CoIP-MS風險：由于存在特異性抗體高豐度蛋白，質譜不一定能夠鑒定到誘餌蛋白。
Co-IP技術案例分析
a) 兩個已知蛋白互作驗證（體內實驗）
常規思路：通過一系列功能實驗確定某個信號通路，明確通路相關蛋白并進行驗證。
文獻中：通過CoIP-WB驗證誘餌蛋白CEBPB和互作蛋白PGC1α是否結合，進一步確定HCP5/miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB通路在胃癌中的作用。
From：MSC-inducedlncRNA HCP5drove fatty acid oxidation through miR-3619-5p/AMPK/PGC1α/CEBPB axis to promotestemness andchemo-resistance of gastric cancer.
b) 通過質譜篩選某個已知蛋白可能結合蛋白（體內實驗）
常規思路：通過組學或其他手段確定某個功能相關蛋白，進一步篩選確定該蛋白作用機理，則可以選擇CoIP-MS.
文獻中：通過CoIP-MS實驗篩選到差異蛋白vimentin，CoIP-WB和GSTpull-down等方法進一步確定P62與vimentin互作。
From：p62/SQSTM1interacts with vimentin toenhance breast cancer metastasis.
c) 通過質譜篩選某個已知蛋白可能結合蛋白（體內實驗）
特點一：使用EGFP融合蛋白標簽做IP實驗。
特點二：則是通過兩次平行CoIP-MS實驗，除了篩選兩次差異蛋白外，進一步將兩次差異蛋白取交集縮小篩選范圍，從中選擇Ngb蛋白互作蛋白。
From：Connecting theDots in the Neuroglobin-ProteinInteraction Network of an Unstressed and Ferroptotic CellDeath NeuroblastomaModel.
Co-IP技術疑點分析
1、Co-IP可不可以用珠子做？比如HIs GST的瓊脂糖？
答：Co-IP是通過磁珠與抗體形成的復合物進行富集，HIs GST的瓊脂糖這些柱料不適用。
2、請問Co-Ip如何選擇合適的Input對照和同型對照？有什么要求和原則嗎？
答：Co-IP使用Input陽性對照即可，Input即實驗使用的細胞裂解液。
3、互作驗證一定要western嗎？純化的蛋白可見呢？
答：可見蛋白只能判斷蛋白大小，還是需要WB確定就是目的蛋白。
4、Co-IP時，Input的帶型不夠亮，怎么解決？
答：可以瞬轉過表達處理。
5、兩個蛋白，哪個適合ip有要求嗎？
答：有IP級別抗體的蛋白優先考慮作為誘餌蛋白。
6、請問Co-IP，INPUT的加樣量是多少？那IgG和IP的上樣量相應有要求嗎？
答：通常上樣量50ug/100ug。
7、免疫共沉淀如何避免假陽性？
答： Co-IP選擇抗體尤為關鍵，特異性抗體可以排除非特異性結合進而排除假陽性。同時可以結合Co-IP反向驗證進一步排除假陽性。若抗體濃度過高，則降低抗體濃度；若抗體特異性不好，則更換抗體。
8、質譜結果幾百個怎么分析可能的互作蛋白？
答：如果蛋白較多，建議先做功能注釋，從中選擇與研究方向功能相關的蛋白；在這些蛋白通過質譜數據（得分）進一步排序，確認2-3個進行驗證。
9、請問是不是在不知互作蛋白的情況下，用質譜或其他方法篩選；如果已知互作蛋白，直接用Co-IP？
答：已知蛋白互作驗證CoIP-WB；未知蛋白互作篩選CoIP-MS。
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