蛋白質(zhì)作為生命體的基本組分, 是細(xì)胞功能的最終執(zhí)行者。研究蛋白質(zhì)之間相互作用是理解生命活動(dòng)的基礎(chǔ)。繼前文分享了四種廣泛應(yīng)用的蛋白質(zhì)相互作用研究策略之后（錯(cuò)過精彩的朋友，請(qǐng)點(diǎn)擊此處回顧），本文將引領(lǐng)大家深入了解第五種強(qiáng)大的技術(shù)——熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)深入探討如何有效解析蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系。

    熒火素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（Luciferase Complementation Assay, LCA）的原理是將熒光素酶蛋白的兩個(gè)片段分別連接到兩個(gè)不同的待測(cè)蛋白上，若兩個(gè)蛋白能夠結(jié)合，則熒光素酶蛋白得以補(bǔ)全酶解底物發(fā)出熒光。熒光素酶互補(bǔ)成像技術(shù)（Luciferase Complementation Imaging, LCI）則是這一原理在成像領(lǐng)域的具體應(yīng)用，允許研究人員在細(xì)胞或生物體內(nèi)直接可視化蛋白質(zhì)相互作用的時(shí)空分布，為復(fù)雜生命過程的研究提供了一種直觀且強(qiáng)大的工具。

    LCA技術(shù)之所以成為研究蛋白質(zhì)相互作用的又一熱門選擇，得益于其眾多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。首先，它具有高靈敏度和高特異性，能準(zhǔn)確捕捉瞬時(shí)且微弱的蛋白質(zhì)相互作用，減少了誤報(bào)的可能性。其次，與傳統(tǒng)的方法相比，LCA能夠在活細(xì)胞環(huán)境中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)相互作用，避免了細(xì)胞裂解帶來的假象。此外，由于其依賴于生物發(fā)光而非熒光或放射性標(biāo)記，背景信號(hào)極低，提高了信號(hào)與噪聲的比例。最后，LCA對(duì)細(xì)胞毒性小，適合長時(shí)間追蹤和高通量篩選。

熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)

    LCA作為一種強(qiáng)大而靈活的工具，已在多個(gè)生命科學(xué)研究領(lǐng)域彰顯其重要價(jià)值，其應(yīng)用范圍廣泛覆蓋從基礎(chǔ)分子生物學(xué)研究到復(fù)雜疾病機(jī)理的探索。而當(dāng)我們將目光聚焦到植物科學(xué)研究領(lǐng)域，LCA的應(yīng)用更是展現(xiàn)出了非凡的意義和影響力，尤其是在探索植物如何應(yīng)對(duì)各種逆境脅迫（如干旱、鹽堿、極端溫度、病原菌侵染等）及其內(nèi)在的抗性機(jī)制方面表現(xiàn)更是優(yōu)秀。下面，我們來看幾個(gè)具體的應(yīng)用案例，深入理解LCA的應(yīng)用及聯(lián)用思路。

應(yīng)用案例一：蘋果樹對(duì) ARD的抗性機(jī)制研究

    該研究旨在揭示蘋果樹對(duì) ARD的抗性機(jī)制，特別是針對(duì)主要病原真菌——F. solani的防御策略。研究圍繞轉(zhuǎn)錄因子MdERF114的功能及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)展開，發(fā)現(xiàn)MdMYB8轉(zhuǎn)錄因子與MdERF114之間存在相互作用。這一結(jié)論是通過多種互作實(shí)驗(yàn)方法得出的，如下圖所示：

圖源：https://doi.org/10.1093/plphys/kiad057

A：酵母雙雜交（Y2H）實(shí)驗(yàn)表明，在酵母中，MdMYB8能夠與MdERF114相互作用。

B：通過熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)MdERF114-Nluc和MdMYB8-Cluc共同注射時(shí)，才會(huì)觀察到熒光信號(hào)，證明二者相互作用。

C：雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)中，觀察到MdMYB8與MdERF114在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生相互作用。

D：Pull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MdERF114-HIS能夠被MdMYB8-GST捕獲，但不能被谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）單獨(dú)捕獲，進(jìn)一步證實(shí)了兩者的直接相互作用。

應(yīng)用案例二：光敏色素B (phyB)調(diào)控下胚軸伸長的分子機(jī)制

    光敏色素B (phyB)介導(dǎo)植物的多種光反應(yīng)，在這項(xiàng)研究中，為了進(jìn)一步闡明phyB調(diào)控下胚軸伸長的分子機(jī)制，通過使用螢火蟲熒光素酶互補(bǔ)成像技術(shù)（LCI），作者映射了BZR1與phyB的相互作用區(qū)域。結(jié)果顯示，phyB不僅與BZR1的N端DNA結(jié)合域直接相互作用，還能與C端轉(zhuǎn)錄激活域發(fā)生作用。這表明phyB可以與BZR1的兩個(gè)關(guān)鍵功能區(qū)域發(fā)生接觸。此外作者還使用酵母雙雜交（Y2H）和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（BIFC）進(jìn)一步證實(shí)了LCI的結(jié)果。這些實(shí)驗(yàn)均顯示phyB確實(shí)能與BZR1的N端DNA結(jié)合域及其C端相互作用，這與LCI的結(jié)果一致，增強(qiáng)了結(jié)論的可靠性。

圖源：doi: 10.1111/jipb.12822

應(yīng)用案例三：甘薯抗逆脅迫機(jī)制研究

    該研究揭示了非串聯(lián)型CCCH鋅指蛋白IbC3H18通過調(diào)節(jié)活性氧、ABA、光合作用及離子交換途徑調(diào)控甘薯逆境脅迫的分子機(jī)理。研究團(tuán)隊(duì)通過酵母雙雜交（Y2H）、熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)（LCA）、雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）及免疫共沉淀技術(shù)（Co-IP）獲得并驗(yàn)證了IbC3H18的互作蛋白IbPR5。過表達(dá)IbPR5能夠通過激活ROS清除系統(tǒng)提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性。該研究闡明了甘薯抗逆轉(zhuǎn)錄因子IbC3H18調(diào)控甘薯逆境應(yīng)答的分子機(jī)制。

圖源：doi: 10.1111/nph.15925

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