RNA，即核糖核酸，是生物體內(nèi)一種重要的生物大分子，它不僅在遺傳信息的傳遞和表達過程中扮演著關(guān)鍵角色，還在基因表達調(diào)控、細胞生長、分化、凋亡等生物學過程中發(fā)揮著重要作用。因此，對RNA的研究具有重要的科學意義和應用價值。

    RNA可以根據(jù)其功能和結(jié)構(gòu)特點分為多個類別，其中包括mRNA（信使RNA）、tRNA（轉(zhuǎn)運RNA）、rRNA（核糖體RNA）以及非編碼RNA（ncRNA）。非編碼RNA又可以細分為多種類型，如長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）、環(huán)狀RNA（circRNA）等。非編碼RNA作為基因組中不直接編碼蛋白質(zhì)的RNA分子，近年來受到了廣泛的關(guān)注，它在調(diào)控基因表達、維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、影響細胞命運決定及參與多種生物學途徑中發(fā)揮著不可或缺的作用。本文將以非編碼RNA為例，深入講解RNA測序數(shù)據(jù)挖掘邏輯和后期實驗設計思路。

一般來說，非編碼RNA功能研究的主線包含3個主要步驟：

    ● 高通量篩選：采用高通量測序技術(shù)（如RNA-Seq）和相應的特異性數(shù)據(jù)庫進行高通量篩選，以獲取差異表達的候選RNA。

    ● 候選非編碼RNA的確定：在測序得到的非編碼RNA中，通常優(yōu)先選擇差異倍數(shù)大、表達水平高、且與研究方向相關(guān)的。

    ● 功能分析與驗證：基于生物信息學預測，設計實驗來驗證非編碼RNA的生物學功能。比如通過實時定量PCR、原位雜交等技術(shù)，驗證RNA在特定樣本或條件下的表達情況。還可以通過RNA pull down、RIP、雙熒光素酶等實驗技術(shù)，檢測與目標RNA相互作用的蛋白質(zhì)或RNA，進一步揭示RNA的生物學功能。然后在動物或細胞模型中驗證RNA的功能和調(diào)控機制，進一步確認其在生理和病理條件下的重要性。
實踐出真知，下面我們一起來看幾篇文獻案例加深下理解。

案例一
circSEPT9可作為TNBC潛在的生物標志物和治療靶點

    越來越多的研究表明，環(huán)狀RNA與許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究旨在探討環(huán)狀RNA circSEPT9在人三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）中的表達、生物學功能及分子機制，并分析其表達調(diào)控機制，為其作為TNBC臨床診斷和治療新的分子靶點提供科學依據(jù)。通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA sequencing, RNA-seq）分析4對TNBC組織和癌旁正常組織，得到差異表達的circRNA表達譜。采用Sanger測序、PCR擴增、RNA酶R消化及放線菌素D處理等方法鑒定circSEPT9。應用實時熒光定量PCR和原位雜交技術(shù)檢測TNBC患者中circSEPT9的表達，分析其表達與臨床病理特征的關(guān)系，進一步評價其預后。通過一系列體內(nèi)外功能實驗，包括染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、熒光素酶報告基因和RIP分析、RNA pull down等，探討circSEPT9在TNBC發(fā)生發(fā)展中的作用及機制。本研究發(fā)現(xiàn)E2F1和EIF4A3可能促進circSEPT9的生物發(fā)生；證實了 E2F1和EIF4A3介導的circSEPT9能夠與miR-637結(jié)合促進LIF的表達及激活LIF/Stat3信號通路，進而促進三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此，circSEPT9可作為TNBC潛在的生物標志物和治療靶點。
 

案例二
circPVT1可被HuR調(diào)控，通過miR-30d/e-CCNF通路促進肺鱗癌細胞的增殖

    環(huán)狀RNA（circRNAs）是一類新型的廣泛存在的非編碼RNA，可以調(diào)控不同的人類疾病，包括癌癥的發(fā)生發(fā)展。然而，關(guān)于circRNAs在肺鱗狀細胞癌（LUSC）中的潛在機制和臨床意義的信息還很少。本研究使用RNA測序（RNA-seq）技術(shù)對LUSC組織和健康肺組織中的RNA表達譜進行了分析。qRT-PCR用于分析circPVT1的表達及其與LUSC預后（即生存分析）的關(guān)系，并進行了體外和體內(nèi)實驗以評估circPVT1對腫瘤生長的影響。作者運用RNA pull-down實驗、質(zhì)譜分析、雙熒光素酶報告基因分析和RNA免疫沉淀實驗，以探究circPVT1、HuR、miR-30d/e在LUSC中的相互作用。結(jié)果顯示circPVT1促進LUSC細胞的增殖。circPVT1可被HuR調(diào)控，circPVT1作為miR-30d和miR-30e的競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA），在減輕miR-30d和miR-30e對其靶基因CCNF的抑制影響方面發(fā)揮作用。綜上所述，circPVT1通過HuR/circPVT1/miR-30d和miR-30e/CCNF級聯(lián)通路促進LUSC進展，這使它有望成為LUSC診斷的新型生物標志物或治療靶點。
 

案例三
circEsyt2通過剪接調(diào)控來調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞重構(gòu)

    冠心病、腦卒中是病人致死、致殘的主要原因。然而，其發(fā)病機制不完全清楚，臨床仍需有效治療策略。因此，進一步揭示這些疾病發(fā)病機制顯得尤為重要。血管平滑肌細胞（VSMC）的表型轉(zhuǎn)化是冠心病、腦卒中、高血壓等重大心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的病理生理學基礎，如何抑制VSMC從收縮態(tài)向分泌態(tài)轉(zhuǎn)化成為大家共同關(guān)注的科學問題。

    作者從多種VSMC表型轉(zhuǎn)化疾病小鼠模型中篩選出高表達環(huán)狀RNA-circEsyt2，通過表型研究發(fā)現(xiàn)，circEsyt2可促進血管平滑肌細胞增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)換等細胞行為。而在小鼠頸動脈損傷模型中，抑制circEsyt2表達可顯著減輕損傷后血管的內(nèi)膜新生，表明circEsyt2具有促進血管重塑的病理生理學功能。進一步研究發(fā)現(xiàn)，位于細胞質(zhì)中的circEsyt2可以直接“吸附”剪接調(diào)控因子PCBP1并阻礙其入核，在核內(nèi)觸發(fā)p53基因的可變剪接事件，生成p53β,進而發(fā)揮調(diào)控血管平滑肌表型轉(zhuǎn)換及血管重構(gòu)的作用。此外，嚴重狹窄的患者冠脈平滑肌細胞中circEsyt2表達顯著升高，進一步提示其與疾病的密切關(guān)聯(lián)。該研究為血管重構(gòu)性疾病的防治新策略提供理論基礎和潛在靶點。

    在探討了三個非編碼文獻案例后，我們可以總結(jié)出RNA功能研究的常規(guī)方案設計，并通過以下流程圖來直觀地表示：

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參考來源：

● https://www.cqmu.edu.cn/info/1096/4459.htm
● https://doi.org/10.1186/s13046-021-01976-w
● https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal0/tab448/info82723.htm
● https://www.researchgate.net/publication/357060325
●https://molecular-cancer.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12943-020-01183-9