SWATH-MS定量蛋白質組學揭示了乳糖酸對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的多靶點抗菌機制
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2020-06-01 16:47:13
熱烈祝賀沈陽農業大學康教授及其團隊研究成果榮登J. Agric. Food Chem.（IF=3.571, JCR 1 區）
題目：Label-Free Quantitative Proteomics Reveals the Multitargeted Antibacterial Mechanisms of Lactobionic Acid against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) using SWATH-MS Technology
期刊：Journal of Agricultural and Food Chemistry
影響因子：3.571
一、研究背景
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）已成為一個嚴重的公共衛生問題，其能夠定殖和感染人類和動物，導致相當高的發病率和死亡率。此外，MRSA對環境因素具有強烈的抗性，并且很容易污染乳制品、肉類和其他食品。一項新的研究表明，人類、動物和環境資源可能與 MRSA在整個生產鏈中對乳制品的污染有關，這對乳制品安全以及食品從業者和消費者的健康構成了嚴重威脅。因此，迫切需要防止和控制MRSA擴散的新型抗菌劑。
新的研究發現乳糖酸（LBA）表現出與乳鏈菌肽和百里酚對單核細胞增生李斯特菌的協同抗菌作用以及對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的抗菌活性。然而，目前還沒有有關LBA對MRSA的抗菌活性和作用機理的相關報道。
在這項研究中，作者運用基于SWATH的定量蛋白質組學以及掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）的超微結構觀察，系統的研究了LBA在蛋白質組水平上對MRSA的抗菌機制。進一步通過基于PRM的靶向質譜技術和實時定量PCR（qRT-PCR）技術驗證了幾種差異表達蛋白的蛋白表達水平和mRNA表達水平。這項研究為LBA對抗耐多藥性致病菌的分子機制提供了重要見解，證明了其在食品安全和制藥中的潛在應用價值。
二、技術路線
三、實驗結果
1. LBA處理的MRSA細胞超微結構的變化
用掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察LBA處理前后MRSA細胞超微結構的變化。未經處理的細胞通過掃描電鏡和透射電鏡顯示出正常、獨立和均勻的細胞質(圖1A，1D)，1/2×MIC(9.375 mg/mL)作用2h，細胞出現不規則皺褶，胞質變薄，聚集，粘附(圖1B和1E)。在1×MIC（18.75 mg / mL）條件下孵育2小時的MRSA細胞因極稀疏的細胞質、細胞內物質泄漏、細胞壁消失和細胞膜破裂而變形（圖1C和1F）。此外，在處理過的細胞的TEM圖像中觀察到的致密顆粒或緊密凝結的物質（紅色箭頭）被認為是DNA凝縮和蛋白質沉淀異常的結果。因此，作者推測LBA不僅可能破壞細菌的細胞壁和細胞膜，也會影響細胞內的蛋白質和DNA。
圖1 LBA處理的MRSA細胞超微結構的變化
2.SWATH定量蛋白質組學
作者利用SWATS-MS技術研究了LBA處理后MRSA細胞的蛋白質組學改變。共定量到1147種蛋白質，其中100為顯著差異蛋白 (|FC|≥1.2, P<0.05)（圖 2A）。圖2B顯示了差異表達蛋白（DEP）的層次聚類熱圖。作者使用Uniprot數據庫分析了DEP的功能，并將其分為幾類，包括蛋白質生物合成（10％），細胞表面蛋白質和毒力因子（8％）等（圖2D）。另外，亞細胞定位預測結果表明，在100個DEPs中，有81個位于細胞質中，有13個位于細胞外基質中，有6個定位在細胞膜上（圖2C）。
圖2 SWATH-MS揭示了對照組和LBA處理組之間差異表達的蛋白質(DEPS)
3.差異表達蛋白分析
3.1氧化應激和DNA修復相關的DEPs
圖3顯示，LBA通過積累細胞內ROS并抑制內源性抗氧化劑MsrB和類胡蘿卜素的活性來引發MRSA的氧化應激反應。過量的ROS也可能引起DNA氧化損傷，從而引起DNA雙鏈斷裂，從而影響任何細胞大分子。
圖3 LBA處理后ROS積累
3.2 細胞表面蛋白和毒力因子
LBA處理2 h后，細胞表面蛋白和毒力因子均下調。并且qRT-PCR分析表明這些基因的表達降低了，與蛋白質組學分析結果一致（圖4）。
圖4 LBA處理后MRSA轉錄表達水平
3.3 DEPs的蛋白質-蛋白質相互作用網絡
PheT與DnaK，GroEL，ArgH，ArgG和PurL的連接表明，翻譯過程中涉及的蛋白質可能觸發蛋白質折疊和降解系統，從而影響核苷酸合成途徑。此外，AhpC與DnaK，GroEL，OdhB，GpmA和GapA2的連接表明，參與氧化應激反應的蛋白質也可能觸發蛋白質折疊和降解系統并抑制碳水化合物的代謝途徑。
圖5 DEP的蛋白質-蛋白質相互作用網絡
3.4其他生物學功能
對其他差異蛋白的分析，我們發現LBA處理MRSA發揮抗菌作用還會影響碳水化合物和氨基酸轉運與代謝，核苷酸、輔酶合成和運輸，細胞壁生物合成，蛋白質生物合成以及MRSA的防御體系等相關功能方面。
四、實驗驗證
作者使用PRM和qRT -PCR對差異蛋白進行驗證。其中PRM驗證的所有靶蛋白與SWATH定量結果趨勢一致（表1）。qRT-PCR驗證的靶蛋白中8個基因的mRNA表達水平與相應的蛋白表達水平呈一致趨勢（圖4和表1），而其余3個基因則與相應的蛋白質表達水平不一致，這可能是由于這些基因的轉錄后調控所致。基于SWATH-MS、PRM和qRT-PCR定量方法的結果總體一致性，表明SWATH定量結果的可靠性。
表1 SWATH-MS、PRM和qRT-PCR相對定量結果比較
五、小結
通過超微結構觀察發現LBA處理后的MRSA在表型上發生了細胞膜褶皺的現象，基于這種表型進一步支持了LBA能作為MRSA的一種抗菌劑。為了闡述這種作用機制，作者基于SWATH-MS的蛋白質組學分析了正常MRSA細胞和LBA處理后的MRSA在蛋白表達水平上的差異，找到了一些差異表達的蛋白，進一步對差異蛋白進行分析，從而闡述了LBA抗MRSA的作用機理。為了驗證組學定量結果的準確性，作者進一步運用基于質譜的PRM技術和qRT-PCR技術，從蛋白和基因層面對差異蛋白進行了驗證，驗證了實驗結果的準確性和一致性。
總的來說，本文在蛋白質組水平上系統地闡述了LBA對MRSA的作用模式。考慮到LBA對MRSA的多靶點作用，作者也提出LBA在食品和制藥防腐劑方面可能具有潛在的應用價值。
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