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【客戶文獻(xiàn)解讀】IF=7.543，多組學(xué)聯(lián)用結(jié)合互作技術(shù)確定RPS4Y1是VKH疾病中重要的CsA和CS抗性基因

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2020-06-19 10:58:42

題目：Identification of Ribosomal Protein S4, Y-Linked 1 as a cyclosporin A plus corticosteroid resistance gene

期刊：Journal of Autoimmunity

影響因子(IF)：7.543

主要技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、慢病毒、雙熒光素酶

研究背景

皮質(zhì)類固醇(CS)聯(lián)合環(huán)孢素A (CsA)被廣泛用于治療自身免疫性疾病、自身炎癥性疾病和移植排斥反應(yīng)。然而，一些患者對(duì)聯(lián)合治療方案沒有反應(yīng)或產(chǎn)生耐藥性。在Vogt-Koyanagi-Harada (VKH)疾病模型中，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)(RNA-seq)、蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)體外檢測(cè)等一系列實(shí)驗(yàn)，以篩選和驗(yàn)證潛在的耐藥分子。研究發(fā)現(xiàn)在CsA、Cs耐藥和-敏感的VKH患者來源的CD4+ T淋巴細(xì)胞中共有1697個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)和21個(gè)差異表達(dá)蛋白(DEPs)。核糖體蛋白S4和Y-Linked 1 (RPS4Y1)被證實(shí)調(diào)節(jié)男性VKH患者CD4+ T淋巴細(xì)胞對(duì)CsA和CS的抗性。作者發(fā)現(xiàn)CLB可以通過抑制RPS4Y1逆轉(zhuǎn)抗性。綜上所述，確定RPS4Y1是VKH疾病中重要的CsA和CS抗性基因。

研究內(nèi)容及結(jié)果

1. CsA和CsA耐藥及敏感VKH患者CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和蛋白譜分析

作者應(yīng)用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)來自12例耐藥患者及19例敏感患者分離的CD4+T淋巴細(xì)胞mRNA表達(dá)水平的差異。與敏感患者相比，作者發(fā)現(xiàn)1697個(gè)差異表達(dá)耐藥患者的基因（DEGs）（1.2倍變化，F(xiàn)DR<0.05）。其中822個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，875個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖1A）。

作者還運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)(iTRAQ)開展了類似研究，發(fā)現(xiàn)與敏感患者相比，在耐藥患者中發(fā)現(xiàn)21個(gè)差異表達(dá)蛋白（6個(gè)上調(diào)表達(dá)，15個(gè)下調(diào)表達(dá)（圖1C））（DEPs）（1.2倍變化，p<0.05）。OmicsBean對(duì)DEGs和DEPs進(jìn)行了功能分析(GO及KEGG) (http://www.omicsbean.cn)。DEGs 的GO分析結(jié)果顯示：4604個(gè)生物過程(BP)，499個(gè)細(xì)胞成分(CC)，631個(gè)分子功能的功能通路被富集出來；此外26條KEGG通路被富集出來（圖1B）。DEPs 的GO分析顯示422個(gè)BPs，93個(gè)CCs，38個(gè)MFs及 13個(gè)KEGG功能通路被富集出來（圖1D）。從GO和KEGG富集出來的通路可以看到，差異基因及蛋白主要是與炎癥和免疫功能相關(guān)的，如NF-kappa B、抗原處理和遞呈及MAPK等途徑。

圖1 耐藥和敏感VKH患者CD4+T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析

（A）火山圖顯示差異基因，與敏感患者相比，耐藥患者的基因上調(diào)（紅色）或下調(diào)（綠色）被認(rèn)為是FDR<0.05，兩者之間的倍數(shù)變化>1.2兩組；

（B） GO和KEGG對(duì)DEGs的功能通路富集，p<0.05被認(rèn)為是顯著的富集；

（C）火山圖顯示與敏感患者相比，耐藥患者中的蛋白質(zhì)顯著上調(diào)（紅色）或下調(diào)（綠色）的DEPs被認(rèn)為是p<0.05，且兩者之間的倍數(shù)變化>1.2兩組；

（D） GO和KEGG對(duì)DEPs的富集，p<0.05為顯著富集。DEPs：差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

2. 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組聯(lián)合分析

通過對(duì)兩個(gè)omics數(shù)據(jù)集（242個(gè)無注釋）的綜合分析作者發(fā)現(xiàn)：RPS4Y1和HLA-DQA1在mRNA和蛋白質(zhì)水平上差異表達(dá)（圖2A）。與敏感患者相比，基因及蛋白層面結(jié)果均顯示RPS4Y1在耐藥患者中上調(diào)，而HLA-DQA1下調(diào)（圖2B）。此外，生物信息學(xué)分析顯示兩個(gè)候選基因參與了45個(gè)重要BPs，9個(gè)CCs，4個(gè)MFs和1重要的KEGG途徑（圖2C）。GO富集分析顯示兩個(gè)基因的詳細(xì)功能分類并對(duì)其進(jìn)行展示（圖2D）。

圖2 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組學(xué)聯(lián)合分析

（A） vene圖重疊部分顯示候選分子RPS4Y1和HLA-DQA1在兩個(gè)omics數(shù)據(jù)集。

（B） RPS4Y1和HLA-DQA1mRNAs與蛋白的相關(guān)性。

（C）對(duì)RPS4Y1和HLA-DQA1進(jìn)行富集分析，p<0.05為顯著富集。

（D） GO富集的詳細(xì)功能分類。

3. RPS4Y1是VKH病中一個(gè)潛在的CS a和CS抗性基因研究

針對(duì)多組學(xué)聯(lián)合分析篩選到的兩個(gè)基因，作者進(jìn)一步通過RT-qPCR和PRM分別進(jìn)行反向驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果顯示：RPS4Y1和HLA-DQA1的蛋白表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。RT-qPCR結(jié)果顯示：RPS4Y1在男性耐藥患者表達(dá)上調(diào)（圖3A），PRM結(jié)果顯示相同的表達(dá)模式（圖3C和D）。另一方面，PRM結(jié)果顯示耐藥患者HLA-DQA1蛋白表達(dá)下降（圖3C和D），與蛋白質(zhì)組實(shí)驗(yàn)結(jié)果保持一致。RT-qPCR結(jié)果顯示耐藥與非耐藥患者HLA-DQA1基因表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。（圖3B）。

圖3 RPS4Y1和HLA-DQA1的驗(yàn)證

（A和B）RT-qPCR法檢測(cè)RPS4Y1（A）和HLA-DQA1
（B）的mRNA表達(dá)，GAPDH做內(nèi)參對(duì)照，11例男性耐藥，10例男性敏感患者檢測(cè)RPS4Y1，17例耐藥，21例敏感患者檢測(cè)HLA-DQA1檢測(cè)。（C） PRM用于驗(yàn)證蛋白質(zhì)RPS4Y1（男性患者）和HLA-DQA1的水平，用R/S比值表示兩組間蛋白水平的倍數(shù)變化，R表示耐藥患者S代表敏感病人。

（D） iTRAQ與PRM結(jié)果的比較。

4. RPS4Y1對(duì)CD4+T細(xì)胞體外抗CsA和CS的調(diào)節(jié)作用

根據(jù)組學(xué)及驗(yàn)證結(jié)果，作者推測(cè)RPS4Y1可能對(duì)CsA及CS耐藥性有一定的調(diào)節(jié)作用并進(jìn)行功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

通過轉(zhuǎn)染過表達(dá)慢病毒感染CD4+T細(xì)胞（來源于5個(gè)男性敏感病人），同時(shí)構(gòu)建干擾siRNA進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞（來源于8個(gè)男性耐藥病人）。作者通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-17+和IFN-γ+CD4+T淋巴細(xì)胞，ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IL-17和IFN-γ細(xì)胞上清含量。結(jié)果顯示CsA和Dex對(duì)IFN-γ+CD4+T細(xì)胞量無明顯影響（圖4A和B）。沉默RPS4Y1后CsA和Dex對(duì)細(xì)胞數(shù)量有下調(diào)影響。

圖4 RPS4Y1在體外調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞對(duì)CsA和CS的抵抗

（A）流式細(xì)胞儀檢測(cè)IL-17+和IFN-γ+CD4+T細(xì)胞占比；（B）ELISA法檢測(cè)8例男性耐藥患者CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ的產(chǎn)生；

（C和D）（C）流式細(xì)胞檢測(cè)IL-17+和IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的細(xì)胞占比

（C）和（D）ELISA檢測(cè)上清IFN-γ的含量。

5. CLB（苯丁酸氮芥）通過抑制RPS4Y1的表達(dá)進(jìn)而抑制VKH患者對(duì)CsA和CS的耐藥性

作者為探究CLB對(duì)耐藥患者作用的機(jī)制探，對(duì)來自于9個(gè)男性抵抗者的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行不同方式的治療分組：包括DMSO（對(duì)照）、CsA和Dex（處理組1）、CLB和CLB加CsA&Dex治療（處理組2）。結(jié)果表明，與DMSO對(duì)照組相比，治療組IFN-γ+CD4+T細(xì)胞占比明顯升高；CLB加環(huán)孢素A和地塞米松治療組降低，輕度CLB治療組減少但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5A）。同時(shí)，ELISA試驗(yàn)的結(jié)果也顯示了同樣的趨勢(shì)（圖5B）。與對(duì)照組相比，CsA和Dex藥物處理組中IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量占比及INF-γ的含量并沒有受到影響（圖5A和B）。IL-17+CD4+T細(xì)胞及IL-17的含量也沒有顯著性差異變化（圖5A）。預(yù)示著CLB可能起著一個(gè)輔助的功能，并推測(cè)這種功能是由于抑制了RPS4Y1功能或者表達(dá)水平引起的。

作者進(jìn)一步通過RT-qPCR檢測(cè)證實(shí)與對(duì)照組相比，添加CLB藥物處理后RPS4Y1的基因表達(dá)量下降，同時(shí)只添加CLB藥物組的表達(dá)量最低（Fig.5C）。這種情況在蛋白層面同樣得到了驗(yàn)證（Fig.5D）。作者同時(shí)觀察到經(jīng)CsA & Dex處理組樣本中RPS4Y1基因及蛋白表達(dá)相對(duì)于DMSO對(duì)照組略微上調(diào)（Fig.5C 和D）。進(jìn)一步通過挽救實(shí)驗(yàn)顯示，CLB聯(lián)合CsA、Dex治療對(duì)IFN-γ+ CD4+ T占比率及IFN-γ的含量的抑制效果在加入RPS4Y1過表達(dá)后消失了（Fig5E-G）。綜合以上結(jié)果顯示：CLB通過抑制RPS4Y1的表達(dá)抵消VKH患者對(duì)CsA及CS的耐藥性。

圖5 CLB通過降低RPS4Y1的表達(dá)逆轉(zhuǎn)VKH患者CD4+T細(xì)胞對(duì)CsA和CS的抗性。

（A）流式細(xì)胞檢測(cè)IFN-γ+CD4+T細(xì)胞，（B）ELISA檢測(cè)9例男性耐藥患者經(jīng)DMSO，CsA&Dex，CLB，CLB&CsA&Dex. 孵育后CD4+T細(xì)胞上清液中IFN-γ的產(chǎn)生

（C）RT-qPCR檢測(cè)RPS4Y1的mRNA水平；（D）Western blot檢測(cè)RPS4Y1的蛋白水平；

（E）Western blot檢測(cè)RPS4Y1蛋白；

（F）流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的頻率。

小結(jié)

作者確定RPS4Y1是CSa和CS抗性基因。并通過功能實(shí)驗(yàn)及挽救實(shí)驗(yàn)探索了關(guān)于RPS4Y1如何表達(dá)增加控制耐藥。進(jìn)一步的證據(jù)發(fā)現(xiàn)RPS4Y1在控制耐藥性中的作用是通過對(duì)藥物CLB輔助及RPS4Y1表達(dá)降低有關(guān)。作者的研究是專注于VKH疾病，但也可應(yīng)用于其他環(huán)境CsA和CS抵抗，包括其他自身免疫性疾病或器官移植，為后續(xù)臨床耐藥基因的篩選及研究提供了鑒定的理論基礎(chǔ)，具有極其重要的研究意義。

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