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Renewable Energy：iTRAQ技術分析揭示了在城市污水中N+離子注入型小球藻的脂質代謝途徑

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2020-10-10 08:45:31

本期解讀

題目：iTRAQquantitative proteomic analysis reveals lipid metabolism pathway of N+ion-implanted C. pyrenoidosa cultivated in municipal wastewater

期刊：RenewableEnergy

影響因子：6.274

合作技術：iTRAQ定量蛋白質組學

一、研究背景

利用城市污水培養產油微藻可有效降低廢水處理和生物柴油生產成本，成為微藻生物柴油研究的熱點。用于生物柴油生產的理想藻類物種應表現出幾種有利的特性，包括高脂質含量，高光合速率，快速生長速率和強抗性。開發獲得工程化高質量藻類的方法是促進微藻生物能源產業可持續發展的關鍵。離子注入技術是微生物誘變和繁殖的一種廣泛使用的方法。但是，這種方法很少用于藻類育種。在作者的初步研究中，通過N+離子注入以誘導小球藻突變，從而顯著提高了小球藻的脂質生產率。在本研究中，作者使用iTRAQ技術定量了小球藻的原始菌株和突變菌株之間差異表達的蛋白質，并分析了這些蛋白質的功能。此外，對差異表達蛋白進行了生物信息學分析，以闡明離子植入促進小球藻突變的分子機制。

二、技術路線

三、實驗結果

1、蛋白質的提取和質控

為了驗證本研究中測試的目標蛋白是否可靠，首先進行了Bradford蛋白定量。隨后，進行了12％的SDS-PAGE凝膠電泳，以確定本研究中提取的蛋白質是否已降解。定量結果（表1）和電泳圖譜（圖1）顯示，樣品蛋白質條帶清晰完整，表明該蛋白質沒有降解，所獲得的蛋白質樣品可用于后續的iTRAQ定量分析。

表1 小球藻的原始菌株（CVW）和突變菌株（CVM）樣品蛋白濃度

圖1 小球藻的原始菌株（CVW）和突變菌株（CVM）SDS-PAGE電泳圖譜

2、差異表達蛋白質功能的注釋

通過iTRAQ定量技術在小球藻細胞中總共鑒定出17種差異表達的蛋白質，包括3種上調的蛋白質和14種下調的蛋白質。對在CVW和CVM之間鑒定的上調和下調的差異表達蛋白進行了獨立的功能注釋。17種差異表達蛋白的GO注釋結果如圖2所示。與生物過程密切相關的蛋白質主要被鑒定為參與細胞和代謝過程的蛋白質。通過將在CVW和CVM之間鑒定到的差異表達蛋白質與COG數據庫進行比較，我們可以預測其可能的功能并根據其功能類型對這些蛋白質進行分類，如圖3所示。大多數蛋白質與“碳水化合物轉運和代謝”或僅與一般功能預測有關。其他一些常見的功能蛋白包括參與“輔酶轉運和代謝”，“翻譯，核糖體結構和生物發生”和“細胞骨架”的蛋白。

圖2 17種差異表達蛋白的GO注釋結果

圖3 差異表達蛋白的COG功能注釋結果

3、差異蛋白功能分析

使用iTRAQ技術，在野生型和突變藻類細胞中總共鑒定出17種差異表達的蛋白質。如表2所示，其中3個是3個上調的蛋白，而14個是下調的蛋白，對差異表達蛋白的功能進行分類后，我們發現它們主要分布在催化酶、ATP/GTP結合蛋白、轉運蛋白和未知蛋白質中。

表2 差異表達的蛋白質

小球藻是一種可以進行光合作用的真核微藻。它可以將光能、二氧化碳（CO2）和水轉化為化學能，以碳水化合物分子的形式存儲在微藻細胞內。小球藻細胞脂質代謝途徑的示意圖如圖4所示。小球藻細胞的中心碳代謝網絡主要由卡爾文循環，糖酵解，PPP和TCA循環組成。卡爾文循環主要提供GAP；糖酵解途徑提供乙酰輔酶A，DHAP，ATP和NADH用于TAG的合成；而PPP提供了NADPH還原所需的脂肪酸合成能力；TCA提供ATP。

圖4 小球藻脂質調節代謝途徑的推定模型

在CVW和CVM藻類細胞之間鑒定出的大多數差異表達蛋白都屬于ATP/ GTP結合蛋白，與能量流密切相關，這些蛋白質中的一些是催化酶。chiL基因編碼的Mg-protopoyrin IX chelatase在突變細胞中被上調了2.85倍。該蛋白是葉綠素合成分支反應中的關鍵酶，有利于葉綠素的合成，從而可以提高光合作用效率，改善微藻細胞中的碳固存效率。

基因CHLNCDRAFT_59826編碼的FBA蛋白在突變細胞中被下調了0.32倍。FBA是糖酵解途徑和卡爾文循環中的關鍵酶，下調阻礙了糖酵解過程中FBP的裂解反應，以及卡爾文循環中以GAP為底物的代謝反應。基因CHLNCDRAFT_48880編碼的TK蛋白下調了0.39倍。TK蛋白在PPP和卡爾文循環中起著重要作用。下調分別阻礙了PPP和卡爾文循環中兩個反應的進行。在卡爾文循環中，FBA和TK的下調將導致GAP在微藻中積累。GAP主要用于合成葡萄糖或進入糖酵解過程后產生丙酮酸，兩者均伴隨著能量的產生。FBA的下調會阻礙FBP在細胞中的裂解反應，因此，通過卡爾文循環從GAP合成的葡萄糖現在主要在通向PPP的途徑中形成G6P。

同時，GAP進入糖酵解過程，GAP底物濃度的增加有助于改善糖酵解過程，從而導致脂肪酸合成的兩種前體乙酰輔酶A和3-磷酸甘油酸的不斷積累。在PPP上，TK的下調將嚴重阻礙GAP內部的兩個可逆反應。在這種情況下，來自糖酵解中間體G6P的氧化產物RuBP在隨后的非氧化階段將形成R5P和Xu5P。G6P底物濃度的積累有利于沿PPP的反應。PPP的增強將導致R5P的積累，R5P主要用于在藻類細胞分裂過程中合成DNA前體核苷酸，為藻類細胞的數量增加提供了遺傳物質基礎。此外，強化的PPP將產生大量的NADPH，可用于合成脂肪酸。

四、小結

離子注入誘變可以通過上調Mg-protopoyrinIXchelatase來提高藻類細胞的固碳效率，從而產生更多的有機物和大量的小球藻，最終導致更大的生物量。同時FBA和TK在微藻突變株中被下調，兩者都促進了糖酵解過程并增強了PPP。增強的糖酵解過程導致脂肪酸和3-磷酸甘油的積累，從而產生大量的ATP。PPP的增強會產生大量的NADPH還原能力，從而為脂肪酸和3-磷酸甘油酯提供充足的氫供應。ATP的能量供應通過多步酰化作用促進了TAG的合成，進而促進了小球藻中脂質的積累。這些發現在蛋白質組學水平上為離子植入誘變促進小球藻突變株高脂質生產率提供了合理化的機制。

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