知無不“研”，DNA pull down 常見疑點解析
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2020-11-17 10:11:17
DNA pull down 常見疑點解析
Q1： 適配子DNA單鏈，可以用帶有互補鏈的磁珠進行pull down嗎？如果可以，效率怎么樣？一般需要怎么優化條件？
A：理論上說,若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補鏈雜交成功,是可以進行pull down實驗的; 效率如何不好確定,這個取決于兩條DNA單鏈是否能雜交成功、蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
Q2： DNA pull down的 原理？
A：針對目標區域設計特異性DNA探針并進行生物素標記，生物素探針可與偶聯在磁珠上的鏈霉親和素結合；細胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針孵育，從而釣取與DNA探針有特異性結合的互作蛋白質。
Q3： 你們對外服務的檢測項目有哪些？
A：細胞、動物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測實驗具體如下:
(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;
(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;
(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;
(4) 細胞學檢測：細胞增殖-MTT/CCK-8, 細胞凋亡, 細胞周期,細胞遷移、侵襲：劃痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;
(5) 外泌體服務：提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測/電鏡/WB)、
測序(miRNA/lncRNA)、蛋白質組學;
(6) 轉錄組及蛋白質組：真核有參轉錄組、無參轉錄組、真核lncRNA、small RNA等。
Q4：效率有多高？
A：效率主要取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
Q5：老師，對照組的DNA序列是怎么選擇的？
A：一般對照組是沒有探針的,對照組是磁珠beads+蛋白。
Q6：DNA pull down有什么缺陷嗎？
A：DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經典技術，是將探針結合在凝膠/磁珠上，釣取與DNA探針有互作的蛋白；就技術而言,沒有明顯的缺陷;后續質譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結合的強弱、蛋白的豐度等。
Q7： 做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好？
A：常規的是用DNA雙鏈作為探針。
Q8： 可以簡單講一下生物素標記引物的原理嗎？
A：主要利用生物素（biotin）和親和素（avidin）這兩種分子的獨特性質; 親和素的每個亞基都能結合一個生物素分子,兩者的結合是通過生物素的脲基環部分完成的;因此可將其戊酸側鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連，構成生物素標記的核酸探針。
Q9： 如果做轉錄因子，轉錄因子和DNA結合發起轉錄，不應是和打開的單鏈結合嗎?
A：啟動子是位于轉錄起始位點（結構基因）5'端上游的DNA序列，就像"開關"，決定基因的活動，本身并不控制基因活動，而是通過與特定蛋白質（轉錄因子）結合而控制基因的活動。轉錄因子就像一面"旗子"，指揮著酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活動，這種酶制造著基因的RNA復制本。轉錄因子是與啟動子DNA雙鏈結合的。
Q10：做100bp突變對照組應該怎么突變堿基？
A：可以通過查找相關資料確定啟動子發揮功能的核心區域,將核心區域進行突變;一般是A/G互換,C/T互換突變。
Q11： DNA互補鏈可以相互釣取嗎？
A：DNA pull down 是研究蛋白-DNA的互作,不可以用DNA互補鏈相互釣取。
Q12：請問DNA為什么會與蛋白質互作呢，它們有什么功能的聯系嗎？
A：DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要應用于尋找已知的啟動子序列所結合的未知蛋白（轉錄因子）；啟動子是位于轉錄起始位點（結構基因）5'端上游的DNA序列，就像"開關"，決定基因的活動，本身并不控制基因活動，而是通過與特定蛋白質（轉錄因子）結合而控制基因的活動。
Q13： 如果做小肽對細菌的作用是否也可以DNA pull down？
A：小肽屬于蛋白類, 做不了DNA pull down。
Q14：未加探針的對照組鑒定出蛋白是什么原因呢？
A：對照組是磁珠beads+蛋白，雖然沒有探針，但少量蛋白可以與磁珠相結合，對照組鑒定到的蛋白是非特異性的背景蛋白。
如果關于DNA pull down你還有很多疑問
如果你對分子互作也還存在些許迷茫
那這期現場直播你可千萬不能錯過
中心經理、技術主管齊上陣
為你詳細講解實驗過程中的操作細節
評論區即問即答
更多代金券、優惠券、現金紅包等你來拿
2020年11月17日（周二）晚八點
我在直播間等你！
掃碼觀看，微信掃碼預約直播，開播前五分鐘會收到開播提醒。(抖音ID：小金博士）
最新動態
-
09.23
中藥的現代詮釋：外泌體如何革新傳統醫學？
-
07.02
1+1＞2！深度解析RNA測序數據挖掘邏輯和后期實驗設計思路，輕松研獲10+ SCI
-
07.01
“稻”亦有道——盤點近期水稻研究的重大突破
-
06.28
科學與美學的結合體：植物亞細胞定位技術詳解
-
06.28
“聚焦新質生產力，激發科研新動能”|LCA躋身蛋白互作研究的新銳力量
-
06.05
知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
-
05.14
四大研究利器(Co-IP、BIFC、Y2H、GST pull-down)助力速配蛋白互作“最佳拍檔”
-
05.14
高效、精準、直觀、實時——取經“蛋白互作研究翹楚”BIFC！
-
05.14
轉染效率低、干擾效果差、重復性欠佳...siRNA研究頻遇“攔路虎”怎么辦？
-
04.22
一文讀懂EMSA技術核心要點，讓“emsa” 秒變“easy”
X 
