首頁集團(tuán)概況技術(shù)專題

知無不”研”|雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果不理想?看這里!

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發(fā)布時(shí)間：2020-11-24 08:59:31

miRNA可以與mRNA結(jié)合調(diào)節(jié)體內(nèi)基因的表達(dá)，通過影響蛋白的表達(dá)、修飾、酶活性等來調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的進(jìn)行。lncRNA作為體內(nèi)的ceRNA，可以與miRNA結(jié)合起到調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用。研究lncRNA與miRNA的相互作用對于研究生命具有重要的意義。通過MS2-RIP和靈敏度更高的雙熒光素酶技術(shù)，來研究lncRNA和miRNA的相互作用。

一、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)服務(wù)簡介

雙光素酶報(bào)告基因通常是一個(gè)報(bào)告基因作為內(nèi)對照，使另一個(gè)報(bào)告基因的檢測均一化。檢測基因表達(dá)時(shí)雙報(bào)告基因通常用來瞬時(shí)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞，帶有實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因的載體和帶有不同報(bào)告基因的第二個(gè)載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)細(xì)胞。通常實(shí)驗(yàn)報(bào)告基因偶聯(lián)到調(diào)控的啟動(dòng)子，研究調(diào)控基因的結(jié)構(gòu)和生理基礎(chǔ)。報(bào)告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動(dòng)子的第二個(gè)報(bào)告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照，使測試不被實(shí)驗(yàn)條件變化所干擾。金開瑞應(yīng)用Promega公司的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(DLR)系統(tǒng)，提供DLR檢測服務(wù)。

二、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)原理

螢火蟲熒光素酶可以催化熒光素氧化成oxyluciferin，在熒光素氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光，生物熒光可以通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

海腎熒光素酶可以催化腔腸素氧化成coelenteramide，在腔腸素氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物熒光，生物熒光可以通過酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。

三、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)應(yīng)用

1.驗(yàn)證microRNA與靶基因（mRNA/lncRNA/circRNA）的互作

miRNA與靶基因結(jié)合后抑制靶基因的翻譯，從而導(dǎo)致螢火蟲熒光素發(fā)光值下降；當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)被突變后熒光值較對照組無差異性變化，證明miRNA是通過結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控靶基因。

2.驗(yàn)證啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的互作

啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后螢火蟲熒光素酶表達(dá)增強(qiáng)，從而導(dǎo)致熒光素發(fā)光值上升；當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)被突變后熒光值較對照組無差異性變化，證明啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子有結(jié)合。

3.啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)分析

將啟動(dòng)子區(qū)域序列（通常2k左右）進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建入luciferase報(bào)告載體，檢測其啟動(dòng)子活性。

4.啟動(dòng)子SNP分析

一些基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在單核苷酸多態(tài)性，可運(yùn)用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析相對活性。

5.驗(yàn)證通路是否激活

將該信號(hào)通路的下游響應(yīng)原件序列構(gòu)建入報(bào)告基因載體，在不同上游信號(hào)條件下，螢光素酶活性代表了通路的下游響應(yīng)。例如，在GPCR研究中，將cAMPresponseelement（CRE）載入報(bào)告基因載體，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，可以用于分析GPCR的激活與抑制劑篩選。又如，將HIF1α的響應(yīng)原件hypoxia-responsiveelement (HRE)插入luciferase報(bào)告載體構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，可用于低氧相關(guān)通路的研究。

四、案例展示

圖.雙光素酶和RIP驗(yàn)證lncRNA可以與miR-26a結(jié)合（引自CCao, Zhang T, Zhang D. et al.The long noncoding RNA, SNHG6-003,functions as a competing endogenous RNA to promote the progression ofhepatocellular carcinoma. Oncogene. 2017 Feb 23;36(8):1112-1122.）

五、部分客戶已發(fā)表文獻(xiàn)

[1] Zhao G, Jiang K, Yang Y, Zhang T, Wu H, Shaukat A, et al. ThePotential Therapeutic Role of miR-223 in Bovine Endometritis byTargeting the NLRP3 Inflammasome. Front Immunol. 2018;9:1916.

[2] Guo T, Wang H, Liu P, Xiao Y, Wu P, Wang Y, et al. SNHG6 Acts as aGenome-Wide Hypomethylation Trigger via Coupling of miR-1297-MediatedS-Adenosylmethionine-Dependent Positive Feedback Loops. Cancer Res.2018;78:3849-64.

[3] Ma J, Liu C, Yang Y, Yu J, Yang J, Yu S, et al. C/EBPbeta ActsUpstream of NF-kappaB P65 Subunit in Ox-LDL-Induced IL-1betaProduction by Macrophages. Cell Physiol Biochem. 2018;48:1605-15.

[4] Zhao G, Yang C, Yang J, Liu P, Jiang K, Shaukat A, et al. Placentalexosome-mediated Bta-miR-499-Lin28B/let-7 axis regulates inflammatorybias during early pregnancy. Cell Death Dis. 2018;9:704.

直播預(yù)告

想知道雙熒光素酶具體操作步驟?

實(shí)驗(yàn)過程中遇到了很多問題不知道怎么解決?

想做服務(wù)又擔(dān)心價(jià)格太貴？

2020年11月24日20:00

中心經(jīng)理攜手技術(shù)工程師為你詳細(xì)講解實(shí)驗(yàn)過程中的操作細(xì)節(jié)！

評(píng)論區(qū)即問即答，超多實(shí)驗(yàn)小技巧！

大額服務(wù)代金券不限購，可疊加！

微信掃碼預(yù)約，開播前五分鐘會(huì)有提醒！