豬鏈球菌（S.suis）是一種主要的豬病原體，可引起多種疾病。此外，豬鏈球菌是一種重要的人畜共患病原體。豬鏈球菌血清型2 (SS2)是毒性最強且最常從患病豬中分離的血清型，最常與人類感染有關。豬鏈球菌血清型2 (SS2)的真核型絲氨酸/蘇氨酸激酶在細菌發病機制中起關鍵作用。在本研究中，用iTRAQ定量蛋白組學分析不同的蛋白質表達譜，特別是那些與細菌病原體有關的蛋白質表達譜，在野生-型(WT) 菌株SS2-1 及其SsSTK突變菌株，目的是揭示參與適應應激環境和豬鏈球菌毒力的蛋白質。

1、SsSTK突變株和WT株的比較蛋白質組分析

iTRAQ定量蛋白組學共鑒定了來自WT 菌株SS2-1 及其突變菌株Δstk 的1120種蛋白質。其中，與WT菌株SS2-1相比，Δstk中281種蛋白質的表達水平存在顯著差異（>1.5倍變化或<0.67倍變化，P值<0.05），其中134種下調和147種上調。

2、DEPs的功能分類注釋分析

為了深入了解281 種差異表達蛋白(DEP)的功能類別，進行了GO分析以生成基于生物過程和分子功能的分類簇（圖1）。

Fig.1 GO enrichment analysis of differently expressed proteins in Δstk.Results are grouped by biological process (a) and molecular function(b)

3、DEPs的KEGG通路分析

為了揭示SsSTK 在SS2 中的作用，進行了KEGG 通路分析（圖2）。DEPs主要參與代謝途徑、次級代謝產物的生物合成和不同環境中的微生物代謝。一般來說，這些DEPs中的大部分都參與了關鍵的代謝和途徑，這可能有助于SS2 的致病性。

Fig. 2 KEGG pathway enrichmentsin DEPs in Δstk. a Up-regulated and b down-regulated proteins

4、SsSTK 調節已知毒力因子

SsSTK 缺失顯著降低了SS2毒力。在281種DEPs中，VFDB預測的毒力因子（VFs）有69種，其中Δstk中有38種下調蛋白（表1）和31種上調蛋白（表2），其中26種是SS2的已知VFs。

5、相互作用網絡分析證實了新發現的 DEP 在已知毒力因子系統中的作用

為了進一步了解這些新發現的DEP在毒力中的作用，作者可視化了由SS2 的已知VF 和VFDB 使用Cytoscape軟件預測的新識別VF 形成的網絡。36種新發現的DEP（黃色節點）參與并補充了毒力相互作用網絡，其中一些在連接已知VF（綠色節點和紅色節點）并形成重要的樞紐蛋白方面發揮重要作用?？傮w而言，結果表明，69種新型DEP 中有37種參與已知毒力網絡，并可能在毒力中發揮作用（圖3）。

Fig.3 Interaction networks ofdifferentially expressed proteins predicted by the VFDB created usingCytoscape. Protein–protein interactions of differentially expressedproteins of S.suis that had a confidence score ≥ 0.4 werevisualized. The lines represent the interactions that exist betweenproteins

6、通過蛋白質印跡分析確認蛋白質組學結果

選擇上調的VF DnaJ(41kD) 和下調的VF OppA(66kD) 來確認比較蛋白質組學分析。EF-Tu蛋白被用作內部參考，因為它的豐度在兩組中相對恒定。蛋白質組學和western印跡的結果一致（圖4）。

Fig.4 Western blot analysis ofcomparative proteomics data. Equal amounts (30 µg for each lane) oftotal bacterial cell proteins were separated on a 12% SDS-PAGE gel,then subjected to western blotting. From left to right the lanes wereloaded with SS2-1 and Δstk samples. Differentially expressed OppA(66 kDa, the first line), DnaJ (41 kDa, the second line) and EF-Tu(44 kDa, the last line) proteins were analyzed using their respectiveantibodies. The CBB-R250-stained gel was used as a loading control.Protein bands were visualized using the ECL substrate

總之，比較蛋白質組分析在突變株Δstk中鑒定了38種下調的VF，這些VF涉及在SS2感染期間對宿主細胞的粘附以及在宿主環境中的適應和存活。先前研究中的表型測定已經證實Δstk突變株在體外和體內的各種應激環境中表現出生長不足并減弱了致病性。因此，STK對細胞生長、應激反應和SS2 的毒力很重要。