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CRISPR技術簡介

信息來源:金開瑞 作者:genecreate 發布時間:2017-04-13 10:59:15

  CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是新出現的一種由sgRNA指導Cas核酸酶對靶向基因進行特定DNA修飾的技術。在這一系統中,sgRNA引導序列靶定位點剪切雙鏈DNA達到對基因組DNA 進行修飾的目的。
  雖然有很多CRISPR–Cas系統需要多種蛋白的參與,但是在很多細菌的胞內都只需要一種內切酶(endonuclease)——Cas9就足夠了,我們將這種CRISPR–Cas系統也稱作2型系統(type II systems)。
  Cas9內切酶在向導RNA的指引下能夠對各種入侵的外源DNA分子進行定點切割,不過主要識別的還是保守的間隔相鄰基序(proto-spacer adjacent motifs,PAM基序)。如果要形成一個有功能的DNA切割復合體,還需要另外兩個RNA分子的幫助,它們就是CRISPR RNA (crRNA)和反式作用CRISPR RNA(trans -acting CRISPR RNA, tracrRNA)。crRNA( CRISPR-derived RNA )通過堿基配對與 tracrRNA (trans-activating RNA )結合形成 tracrRNA/crRNA 復合物,此復合物引導核酸酶 Cas9 蛋白在與 crRNA 配對的序列靶位點剪切雙鏈 DNA。不過最近有研究發現,這兩種RNA可以被“改裝”成一個向導RNA(single-guide RNA, sgRNA)。這個sgRNA足以幫助Cas9內切酶對DNA進行定點切割。最新的報道稱,在多種類型的細胞和生物體內,這種RNA介導的Cas9酶切作用能夠正常地行使功能,在完整基因組上的特定位點完成切割反應。這樣就可以方便地進行后續的基因組改造工作了。
  細胞通常會通過兩種方式對發生雙鏈斷裂的DNA進行修復,這兩種方式分別是同源重組修復機制(homologous recombination, HR)和非同源末端連接修復機制(non-homologous end joining, NHEJ),不過在修復的過程中細胞有可能會對修復位點進行修飾,或者插入新的遺傳信息。
  為滿足不同實驗需求,金開瑞現推出CRISPR/Cas9技術服務,可根據您的需要量身定制您專屬的CRISPR/Cas9載體,包括pCas9/gRNA1 載體和pCas9/gRNA3 載體,并可利用pCas9/gRNA1或pCas9/gRNA3 載體進行基因敲除服務。
  (1)pCas9/gRNA1 載體可在哺乳動物細胞內同時表達人源化 Cas9 蛋白和 gRNA,只需轉染一個質粒就能實現對靶基因的切割。

Cas9對DNA切割示意圖

pCas9/gRNA1 載體
  (2)pCas9/gRNA3 載體可在哺乳動物細胞內同時表達人源化 Cas9Nickase 蛋白和 gRNA。
  Cas9Nicknase 是 Cas9 蛋白的 D10A 突變體,切割 DNA 單鏈。由于 DNA 上的 Nick 缺口會很快被細胞修復,一般不會造成基因突變。 Cas9Nicknase 需要成對的 gRNA 輔助才能實現 DNA 雙鏈斷裂。采用 Nicknase 蛋白可以提高基因敲除的特異性,但是對 gRNA 的設計要求較高。敲除效率也比 Cas9 蛋白低一些。簡單地說, Cas9 基因敲除效率更高,操作更容易; Cas9Nicknase 特異性更高。

Cas9Nicknase對DNA切割示意圖

pCas9/gRNA3 載體
  



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