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WB檢測全攻略

信息來源：金開瑞作者：genecreate 發布時間：2017-12-11 17:09:22

Western Blot,對于任何一個科研君都不陌生，但是，為甚么別人的實驗時間短、跑膠快、成像顯影辣么好看活生生的羨慕，嫉妒，hen (哼)，足足被甩了幾篇SCI…內情你知否？

除了實驗精細化操作，選擇合適最佳的實驗試劑，還有呢？當然離不開你的優化設計你對關鍵步驟的步步為營。

本文旨在通過提供建議，幫助您在最短的時間、以最少的終端用戶優化調整得到預期結果，提升免疫印跡效果。PS：科研是不斷進步的過程，有不當之處，望指正。

何為蛋白印跡（WB）

蛋白印跡也稱作免疫印跡，是一種被廣泛應用并得到公認的技術，用于檢測細胞或組織提取物中的蛋白表達水平。

這一技術利用抗體與特定待檢測蛋白的結合，測定生物樣本中的蛋白水平。抗體與其靶點蛋白表位的精確結合可用于檢測蛋白質中具有高度特異性的氨基酸序列。

一句話講完WB：就是抗原抗體反應！

Western Blot 可以：

1.從蛋白質混合物中檢出目標蛋白質；

2.定量或定性確定細胞或組織中蛋白質的表達情況；

3.用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA、蛋白質-RNA相互作用后續分析。

▲WB涉及的領域

▲WB操作關鍵步驟

以下，會從關鍵步驟入手，我們將給出試劑和實驗過程的建議，逐一介紹每個步驟中的一些關鍵注意點以及給出對應優化后的圖表，供大家參考

一、裂解產物制備

1.組織裂解

常見破碎組織的方法：機械法、勻漿法、超聲波破碎解、研磨法，反復凍融法等；

實驗室常用的破碎方法：

1.超聲波；

2.電動研磨；

3.磁珠破碎法。（注意磁珠高速旋轉時產生的熱量比較多，需提前把機器放在冰箱制冷）

以上主要注意發熱引起的蛋白變性和聚集，操作過程中盡量減少細節上的差異，這樣才能保證實驗結果的重復性比較一致。

2.細胞裂解

一般裂解液包含以下幾個組分:

1. 緩沖系統；

2. 鹽離子；

3. 離液劑；

4. 蛋白酶抑制劑；

5. 還原劑

▲根據目的蛋白選擇合適的裂解液

▲常見蛋白酶磷酸酶抑制劑

二、凝膠電泳

1.加入足量的樣品和分子量大小標記物

SDS-PAGE 根據蛋白電泳遷移率將其分離，遷移率是蛋白大小和電荷的函數。

我們建議在預制 Tris-Glycine 小孔膠上樣20-40μg 全細胞裂解液或100ng純化蛋白，根據目標蛋白的表達量優化上樣量。

對于大分子量靶標，我們建議采用 Tris-Acetate 凝膠和相關緩沖液。

應在待測樣本附近的泳道始終加入分子量標記物，作為參考點。

分子量標記物（或梯狀條帶）是已知分子量的純化蛋白的混合物。

采用預染色標記可以看見電泳過程中蛋白遷移的距離，隨后確認經電轉移至膜。

采用生物素標記物可以看見膜上的梯狀條帶和抗體靶標。

2.選擇合適的蛋白marker

預染蛋白marker應用：

?實時監控SDA-PAGE中的蛋白遷移

?檢驗western轉膜效率

?對蛋白大小進行初略鑒定

?呈彩色且轉膜效果好

▲電泳凝膠制備參考濃度

三、轉膜

1.濕轉移

把蛋白從凝膠轉移至膜上的濕轉移是指把濾紙-凝膠-膜-濾紙“三明治”完全浸入緩沖液中。使用此方法時，在浸沒的情況下通過電泳轉移至 0.2 μm 孔徑硝酸纖維素膜，在冷卻的含 20% 甲醇的轉移緩沖液中轉膜，70V，1.5小時。

2.半干轉移

把蛋白從凝膠轉移至膜上的半干轉移是指將浸滿緩沖液的濾紙-凝膠-膜-濾紙“三明治”系統，置于本應干燥的陽極和陰極板上。

在這一系統中，轉移在桌面上進行，在室溫條件下約15-60分鐘。轉移低分子量和高分子量蛋白時這一系統均運轉良好，相較于濕轉移所需緩沖液更少，但是在某些情況下會產生更高的背景染色。（轉膜時不離人，監測電流電壓）

3.干轉移

把蛋白從凝膠轉移至膜的干轉移是指不額外加入緩沖液的系統，因為陽極和陰極板系統中含有緩沖液基質。對于較大分子量蛋白，觀察到信號差異最大，表明轉移效率低。

（注意：在樣本量有限或待檢測蛋白低內源水平的情況下，干轉移方法會限制您分析的靈敏度。）

▲Trans Blot

四、封閉

建議轉移之后迅速在 Tris-Buffered Saline (TBS) 中洗滌膜，以便移除殘留的轉移緩沖液，隨后在室溫條件下含5% 脫脂牛奶的 Tris Buffered Saline 和 Tween® 20 去污劑 (TBST)中封閉1小時。這一封閉步驟有助于降低非特異性一抗結合并降低背景。應避免膜封閉時間過長，因為這會掩蓋抗原表位，阻止抗體結合。封閉后在TBST 中洗滌5分鐘。

五、一抗、二抗孵育

1.加一抗與抗原結合

?一抗應在含5% BSA 或5% 脫脂牛奶的 TBST 緩沖液中稀釋。

?一抗孵育時間會有很大的差別，具體取決于研究人員采用的操作流程。建議在4℃ 過夜孵育一抗。（過夜孵育提高抗體結合）

?免疫印跡操作流程的另一個存在差異的方面是洗滌和稀釋緩沖液。推薦抗體稀釋緩沖液和洗滌步驟使用TBST。(TBST 緩沖液產生更強的信號)

2.加二抗與一抗的結合

?建議在含 5% 脫脂牛奶的 TBST 中稀釋二抗。

?因為脫脂牛奶的封閉要更強，所以基于 BSA 的稀釋比基于牛奶的稀釋產生的背景明顯更強。

?如果對免疫沉淀細胞裂解物進行免疫印跡實驗，考慮采用構象或鏈特異性二抗，以避免 IgG 重鏈或輕鏈的信號。

這個步驟的成敗

關鍵看試劑質量的好壞

用的抗體不到位

整個實驗都白費

有木有

六、檢測

一般使用辣根過氧化物酶HRP-ECL發光法或堿性磷酸酶AP-NBT/BICP顯色法。

1．HRP-ECL發光法：

將A、B發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于A、B混合液滴上，熄燈至可見淡綠色熒光條帶（5min左右）后濾紙貼角吸干，置于保鮮膜內固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干，標定Marker，進行分析與掃描。

2．AP-NBT/BICP顯色法：

每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前將一片分裝在30個 EP管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將PBST或TTBS洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸干，反貼法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s后每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗后放濾紙上晾干即可觀察與掃描。背景深淺與一抗的質量及二抗的量有關，當然如果曝光時間長達半小時，出現背景是正常的。

▲顯色

干貨是不是很受用，明明白白做實驗，善其事前利其器，普通問題常規避，優化成功沒問題。

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