膠體金標記及應用
信息來源：金開瑞 作者：genecreate 發布時間：2018-03-21 10:25:16
膠體金是氯金酸在還原劑的作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用形成一種穩定的膠體狀態，故稱之為膠體金。膠體金溶液的常見制備方法大致分為白磷還原法、硼氫化鈉還原法、抗壞血酸鹽還原法、檸檬酸三鈉還原法和鞣酸檸檬酸三鈉還原法。其基本原理是向一定濃度的金溶液內加入適量還原劑，使金離子還原為金原子。通過改變反應體系中氯金酸與還原劑的比例可得到所需不同直徑的金顆粒。
一. 膠體金標記
在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負電荷，可與目標蛋白質所帶正電荷基團之間形成非共價鍵的靜電吸引而牢固結合，這種結合對所標蛋白的生物學活性無明顯影響。吸附在膠體金表面的抗原或抗體能定向將膠體金顆粒載運到組織或細胞內、固相載體上相應抗體或抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標記物在抗原抗體反應處聚集達到一定密度時（即金顆粒107個/mm2），出現肉眼可見的粉紅色斑點。
進行膠體金標記需要對pH環境、蛋白/抗體濃度、參數進行優化，采用的方法為濃度梯度法。
A 最適pH選擇
pH是標記過程的關鍵決定因素，一般在蛋白/抗體等電點pI略偏堿性的環境下標記效果最好，可以采用加入0.1 M碳酸鉀或者0.1 N鹽酸的方法調節膠體金溶液的pH。同時，因為膠體金溶液可能損傷探頭，所以常采用精密pH試紙進行pH測定。操作時將膠體金溶液調節到3~10八個pH梯度，加入被標記的蛋白/抗體，混合后室溫放置15 min，再加入10%氯化鈉室溫放置15 min，記錄保持紅色的最低pH，記為pH0；然后設置pH梯度為pH0-0.6、pH0-0.3、pH0、pH0+0.3、pH0+0.6、pH0+1，重復前面的操作，直到找到室溫放置2 h仍保持紅色的最低pH。
一般我們標記抗體IgG最適pH在9.0，單克隆抗體在8.2，SPA（proteinA）在5.9-6.2，其他常用的蛋白標記pH見下表：
一. 膠體金標記
在堿性條件下，膠體金顆粒表面帶負電荷，可與目標蛋白質所帶正電荷基團之間形成非共價鍵的靜電吸引而牢固結合，這種結合對所標蛋白的生物學活性無明顯影響。吸附在膠體金表面的抗原或抗體能定向將膠體金顆粒載運到組織或細胞內、固相載體上相應抗體或抗原的位置。由于金顆粒具高電子密度的特性，這些標記物在抗原抗體反應處聚集達到一定密度時（即金顆粒107個/mm2），出現肉眼可見的粉紅色斑點。
進行膠體金標記需要對pH環境、蛋白/抗體濃度、參數進行優化，采用的方法為濃度梯度法。
A 最適pH選擇
pH是標記過程的關鍵決定因素，一般在蛋白/抗體等電點pI略偏堿性的環境下標記效果最好，可以采用加入0.1 M碳酸鉀或者0.1 N鹽酸的方法調節膠體金溶液的pH。同時，因為膠體金溶液可能損傷探頭，所以常采用精密pH試紙進行pH測定。操作時將膠體金溶液調節到3~10八個pH梯度，加入被標記的蛋白/抗體，混合后室溫放置15 min，再加入10%氯化鈉室溫放置15 min，記錄保持紅色的最低pH，記為pH0；然后設置pH梯度為pH0-0.6、pH0-0.3、pH0、pH0+0.3、pH0+0.6、pH0+1，重復前面的操作，直到找到室溫放置2 h仍保持紅色的最低pH。
一般我們標記抗體IgG最適pH在9.0，單克隆抗體在8.2，SPA（proteinA）在5.9-6.2，其他常用的蛋白標記pH見下表：
B 蛋白濃度優化
優化了pH值后，繼續優化標記的最低蛋白/抗體濃度，也是采用梯度法，用不同濃度蛋白/抗體溶液與膠體金（已處于最佳pH環境）溶液混合后室溫放置15 min，加入10%氯化鈉室溫放置2 h，測定OD520~580，以吸光值對蛋白/抗體濃度作圖，取線性趨勢線與橫軸交點的蛋白/抗體濃度為最小蛋白/抗體濃度。
確定了最適pH及最小蛋白/抗體濃度后，可以開始進行金標記了。在調節好pH的膠體金溶液中邊迅速攪拌邊逐滴加入蛋白/抗體（濃度是之前確定的最小值的1.2倍），5min內加完，再加入10% BSA至BSA終濃度為1%，攪拌10 min。低溫超速離心去除未標記蛋白/抗體及未充分標記的膠體金，具體方法可參考：先1500 rpm低速離心1 h去掉沉淀，然后15000 rpm離心1 h去掉上清，沉淀用含1% BSA的TBS溶解，重復高速離心三遍，得到可用于試紙條制備的金標蛋白/抗體溶液。
C參數優化
樣品墊與金標墊的組合優化
樣品墊處理液的pH設置三個梯度（7.2、8.0、9.0），金標蛋白/抗體溶液設置三個稀釋倍數（1:1、1:2、1:3）制成金標墊，交叉組合觀察加入陽性、陰性對照（生理鹽水）后的顯色情況（T線和C線均以1 mg/mL的濃度包被）。
優化了pH值后，繼續優化標記的最低蛋白/抗體濃度，也是采用梯度法，用不同濃度蛋白/抗體溶液與膠體金（已處于最佳pH環境）溶液混合后室溫放置15 min，加入10%氯化鈉室溫放置2 h，測定OD520~580，以吸光值對蛋白/抗體濃度作圖，取線性趨勢線與橫軸交點的蛋白/抗體濃度為最小蛋白/抗體濃度。
確定了最適pH及最小蛋白/抗體濃度后，可以開始進行金標記了。在調節好pH的膠體金溶液中邊迅速攪拌邊逐滴加入蛋白/抗體（濃度是之前確定的最小值的1.2倍），5min內加完，再加入10% BSA至BSA終濃度為1%，攪拌10 min。低溫超速離心去除未標記蛋白/抗體及未充分標記的膠體金，具體方法可參考：先1500 rpm低速離心1 h去掉沉淀，然后15000 rpm離心1 h去掉上清，沉淀用含1% BSA的TBS溶解，重復高速離心三遍，得到可用于試紙條制備的金標蛋白/抗體溶液。
C參數優化
樣品墊與金標墊的組合優化
樣品墊處理液的pH設置三個梯度（7.2、8.0、9.0），金標蛋白/抗體溶液設置三個稀釋倍數（1:1、1:2、1:3）制成金標墊，交叉組合觀察加入陽性、陰性對照（生理鹽水）后的顯色情況（T線和C線均以1 mg/mL的濃度包被）。
這里主要是對樣品墊處理液pH及金標物質的濃度進行優化，另外我們也可以對樣品墊和金標墊的處理液成分進行優化，這需要設計各種組合進行測試。
T線、C線包被濃度優化
將要包被的抗體進行1:1、1:2、1:3的稀釋，包被NC膜后經陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數（濃度）。
將要包被的抗原進行1:10、1:20、1:40、1:50、1:100的稀釋，抗體濃度采用上一步優化的濃度，包被NC膜，經陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數（濃度）。
當然，我們也可以采用組合試驗進行二者包被濃度的優化。
檢測墊封閉時間優化
檢測墊封閉時間設定1 h、0.5 h、1 h、2 h四個梯度，用之前優化的參數組裝試紙條，加入陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳封閉時間。同時，我們也可以對BSA的濃度進行優化，以及對包被物質的選擇進行優化，或者進行多個參數的組合優化。
二．免疫膠體金標記技術的應用
早期免疫膠體金標記技術主要應用于光學顯微鏡觀察細胞表面抗原進行組化研究，但因靈敏度低而受到限制，IGSS創立以后免疫金標記技術得到了廣泛應用。目前，免疫膠體金標記技術在組化中的應用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下清晰可辨，因此該技術進一步在電鏡上使用，由對組織細胞定位研究，進一步深入到了基因轉錄水平、基因表達的檢測、染色體的基因定位、特定核酸序列在細胞內的空間分布分析及核酸復制過程中的定性與定量分析等。
將要包被的抗體進行1:1、1:2、1:3的稀釋，包被NC膜后經陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數（濃度）。
將要包被的抗原進行1:10、1:20、1:40、1:50、1:100的稀釋，抗體濃度采用上一步優化的濃度，包被NC膜，經陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳稀釋倍數（濃度）。
當然，我們也可以采用組合試驗進行二者包被濃度的優化。
檢測墊封閉時間優化
檢測墊封閉時間設定1 h、0.5 h、1 h、2 h四個梯度，用之前優化的參數組裝試紙條，加入陽性、陰性對照（生理鹽水）檢測觀察顯色情況，選擇最佳封閉時間。同時，我們也可以對BSA的濃度進行優化，以及對包被物質的選擇進行優化，或者進行多個參數的組合優化。
二．免疫膠體金標記技術的應用
早期免疫膠體金標記技術主要應用于光學顯微鏡觀察細胞表面抗原進行組化研究，但因靈敏度低而受到限制，IGSS創立以后免疫金標記技術得到了廣泛應用。目前，免疫膠體金標記技術在組化中的應用已日趨普遍，膠體金探針的種類也越來越多。由于膠體金的高電子密度使其在電鏡下清晰可辨，因此該技術進一步在電鏡上使用，由對組織細胞定位研究，進一步深入到了基因轉錄水平、基因表達的檢測、染色體的基因定位、特定核酸序列在細胞內的空間分布分析及核酸復制過程中的定性與定量分析等。
最新動態
-
09.23
中藥的現代詮釋：外泌體如何革新傳統醫學？
-
07.02
1+1＞2！深度解析RNA測序數據挖掘邏輯和后期實驗設計思路，輕松研獲10+ SCI
-
07.01
“稻”亦有道——盤點近期水稻研究的重大突破
-
06.28
科學與美學的結合體：植物亞細胞定位技術詳解
-
06.28
“聚焦新質生產力，激發科研新動能”|LCA躋身蛋白互作研究的新銳力量
-
06.05
知無不“研”|一文讀懂免疫共沉淀技術（Co-IP）
-
05.14
四大研究利器(Co-IP、BIFC、Y2H、GST pull-down)助力速配蛋白互作“最佳拍檔”
-
05.14
高效、精準、直觀、實時——取經“蛋白互作研究翹楚”BIFC！
-
05.14
轉染效率低、干擾效果差、重復性欠佳...siRNA研究頻遇“攔路虎”怎么辦？
-
04.22
一文讀懂EMSA技術核心要點，讓“emsa” 秒變“easy”
X 
