題目：Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle

泛素化修飾組學(xué)研究晝夜節(jié)律調(diào)控機(jī)制

期刊：Cell Reports

影響因子：8.032

主要技術(shù)：泛素化修飾組學(xué)

 

研究背景：

        晝夜節(jié)律機(jī)制幫助生物個(gè)體調(diào)整其生理功能以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。早期的機(jī)制研究多集中在轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制基礎(chǔ)之上，隨著研究的深入，蛋白水平調(diào)控，特別是各種翻譯后修飾，如泛素化，對(duì)晝夜節(jié)律的調(diào)控同樣起到了重要作用。

 

研究結(jié)果

1. 泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定晝夜節(jié)律相關(guān)蛋白

        作者利用基于泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，對(duì)處于不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的果蠅頭部樣本進(jìn)行泛素化label free質(zhì)譜檢測(cè)分析，每組樣本包含三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。果蠅頭部提取物中的時(shí)鐘蛋白質(zhì)主要來(lái)源于視網(wǎng)膜，視網(wǎng)膜具有自己的時(shí)鐘基因，而恒定黑暗中的運(yùn)動(dòng)活動(dòng)節(jié)律很大程度上取決于腦時(shí)鐘網(wǎng)絡(luò)的小側(cè)腹神經(jīng)元（sLNv）振蕩器。因此，作者將tim + clock細(xì)胞的泛素化組學(xué)數(shù)據(jù)與胚胎神經(jīng)細(xì)胞和成人光感受器的兩個(gè)泛素化組學(xué)數(shù)據(jù)集進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)在光感受器和時(shí)鐘細(xì)胞中同時(shí)存在91種泛素化蛋白（圖 1D）。在不同的時(shí)間節(jié)點(diǎn)之間的泛素化修飾的差異蛋白有52個(gè)（圖1E），在這些差異蛋白中，一個(gè)核孔復(fù)合物蛋白MTOR的豐度變化隨著時(shí)間的變化尤其顯著（圖1F）。一般情況下泛素化蛋白豐度的倍數(shù)變化集中在2倍以下（圖 1G），這與哺乳動(dòng)物肝臟中總蛋白水平的晝夜節(jié)律相似。作者對(duì)52個(gè)候選蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)泛素化蛋白質(zhì)不均勻相分布，大多數(shù)在CT6達(dá)到峰值（n = 43）。因此，作者認(rèn)為，時(shí)鐘細(xì)胞中的蛋白質(zhì)泛素化集中在白天，而晝夜節(jié)律控制的蛋白質(zhì)合成主要集中于CT7（中午）和CT19（午夜），以雙峰方式呈現(xiàn)。

圖1 泛素化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定晝夜節(jié)律相關(guān)蛋白

 

2. MTOR蛋白節(jié)律泛素化

        為了驗(yàn)證組學(xué)結(jié)果，作者選擇了幾個(gè)候選蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，有四個(gè)候選蛋白（HSP83，NRV2，MTOR和SGG）顯示出可識(shí)別的泛素化，但是只有純化的bioUb樣品的MTOR免疫印跡結(jié)果表現(xiàn)出泛素化節(jié)律性（圖 2A和2B）。為了控制總蛋白水平的可能節(jié)律性，作者選擇抗MTOR印跡果蠅頭部裂解物，發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)水平?jīng)]有明顯變化（圖 2C），這表明MTOR的泛素化程度是受到調(diào)控的。MTOR是與NUP153形成核籃的最內(nèi)核孔蛋白，它參與細(xì)胞分裂的控制并在染色質(zhì)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

        為了研究這種調(diào)控對(duì)節(jié)律的影響，作者利用RNAi的技術(shù)敲除MTOR，發(fā)現(xiàn)敲除導(dǎo)致行為周期延長(zhǎng)并降低節(jié)律性的幅度（圖2D）。

圖2 MTOR的節(jié)奏泛素化

 

3. MTOR的泛素化影響晝夜節(jié)律的分子機(jī)制

        MTOR作為核孔蛋白促使作者研究了Mtor RNAi蠅的sLNv中PER、TIM的亞細(xì)胞定位和在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的蛋白水平，來(lái)探究其影響晝夜節(jié)律的分子機(jī)制。PER和TIM通常從CT18開(kāi)始經(jīng)歷由精細(xì)調(diào)節(jié)的細(xì)胞質(zhì)到核的轉(zhuǎn)變，以實(shí)現(xiàn)它們作為轉(zhuǎn)錄抑制因子的作用。與野生型相比，TIM和PER在Mtor RNAi sLNvs的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)顯示出更多的細(xì)胞質(zhì)定位（圖3），表明這些蛋白質(zhì)的核定位缺陷可能導(dǎo)致行為期延長(zhǎng)。午夜時(shí)分，TIM和PER的表達(dá)水平有非常顯著的提升，早上TIM和PER的降解速度也變慢。綜上表明，MTOR通過(guò)影響下游TIM及PER蛋白的定位及泛素化水平，進(jìn)而控制果蠅節(jié)律。

圖3 PER和TIM亞細(xì)胞定位
 

圖4 MTOR的泛素化影響晝夜節(jié)律的分子機(jī)制

研究小結(jié)

        作者認(rèn)為，除控制節(jié)律性蛋白質(zhì)降解外，晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的泛素化可能會(huì)引導(dǎo)蛋白質(zhì)功能的震蕩變化，如果蠅中核孔復(fù)合體蛋白MTOR受到周期性泛素化的調(diào)控，影響其蛋白表達(dá)量，并且在晝夜節(jié)律分子振蕩器的反饋系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。

 

解析文獻(xiàn)

Áron Szabó, Christian Papin,et al. Ubiquitylation Dynamics of the Clock Cell Proteome and TIMELESS during a Circadian Cycle. Cell Reports, 2018 , 23 (8) :2273-2282.

 

參考文獻(xiàn)

1. Low, T.Y., Magliozzi, R., Guardavaccaro, D., and Heck, A.J. Unraveling the ubiquitin-regulated signaling networks by mass spectrometry-based proteomics.Proteomics, 2013,13, 526–537.

2. Robles, M.S., Cox, J., and Mann, M. In-vivo quantitative proteomics reveals a key contribution of post-transcriptional mechanisms to the circadian regulation of liver metabolism. PLoS Genet, 2014, 10, e1004047.

3. Mauvoisin, D., Dayon, L., et al. Proteomics and circadian rhythms: it’s all about signaling!. Proteomics,2015, 15, 310–317.

4. Wang, J., Mauvoisin, D., Martin, E., et al. Nuclear Proteomics Uncovers Diurnal Regulatory Landscapes in Mouse Liver. Cell Metab, 2017, 25, 102–117.